ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex svejset rør til kemisk industri kemisk komponent, mangel på SPECC1L fører til øget stabilitet af splejsede led og reduceret udskillelse af kraniale neurale kamceller.

Tak fordi du besøgte Nature.com.Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).For at sikre løbende support viser vi desuden siden uden styles og JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex svejset rør til kemisk industri

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.er en førende producent, der er specialiseret i sømløse rør i rustfrit stål, lyse udglødede rør, sømløse oprullede rør osv.For at lette kunderne har vi også svejste rør og rør.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.har det mest avancerede produktions- og testudstyr.Vi kan fuldt ud tilfredsstille dit krav.I henhold til standarden meget strengt, har rør, som produceres af os, altid korrekt OD og WT tolerance.Tolerancekontrollen er strengt i overensstemmelse med producerede standarder.Vores produkter er altid tilfredse med kunderne.Kunder købte vores produkter skabte mere overskud.
a) OD (ydre diameter): 3,18 mm til 101,6 mm
b) WT (vægtykkelse): 0,5 mm til 20 mm
c) Længde: I henhold til kundens krav
d) Standarder: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 osv
e) Procesmetode: ERW, EFW osv

Sliders, der viser tre artikler pr. slide.Brug tilbage- og næste-knapperne til at flytte gennem diasene, eller dias-controllerknapperne i slutningen til at flytte gennem hvert dias.
De cranial neural crest celler (CNCC) smuldrer af de embryonale neurale folder og migrerer til svælgbuerne, som danner de fleste af midtersidens strukturer.CNCC dysfunktion spiller en vigtig rolle i ætiologien af ​​orofacial spalte, en almindelig medfødt misdannelse.Heterozygote SPECC1L-mutationer er blevet fundet hos patienter med atypiske og syndromiske kløfter.Her rapporterer vi forbedret farvning af kanoniske adhæsive junction (AJ) komponenter, β-catenin og E-cadherin i dyrkede SPECC1L knockdown-celler, og elektronmikrografer viser apikal-basal diffusion af AJ.For at forstå SPECC1L's rolle i kraniofacial morfogenese oprettede vi en Specc1l-mangelfuld musemodel.Homozygote mutanter er embryonale dødelige og udviser nedsat neuralrørslukning og CNCC-laminering.AJ-proteinfarvning er øget i mutante neurale folder.Denne AJ-defekt er i overensstemmelse med en defekt i CNCC-delaminering, der kræver AJ-opløsning.Derudover har Specc11-mutanter reduceret PI3K-AKT-signalering og øget apoptose.In vitro var mild inhibering af PI3K-AKT-signalering i vildtypeceller tilstrækkelig til at inducere AJ-ændringer.Det er vigtigt, at AJ-ændringer induceret af SPECC1L knockdown kan vendes ved aktivering af PI3K-AKT-vejen.Tilsammen tyder disse data på, at SPECC1L, som en ny regulator af PI3K-AKT-signalering og AJ-biologi, er påkrævet til neuralrørslukning og CNCC-stratificering.
Cranial neural crest-celler (CNCC'er) lokaliseres til den dorsale neuroectoderm og løsnes fra neuroepithelet i de udviklende neurale folder gennem en proces, der involverer epitel-mesenchymal overgangen (EMT)1,2,3.Præmigrerende epiteliale CNCC'er forstyrrer intercellulære forbindelser og bliver til migrerende mesenkymale CNCC'er, der fylder den første og anden svælgbue og danner det meste af kraniofaciale brusk.Således er gener, der regulerer CNCC-funktionen, ofte forstyrret i ætiologien af ​​kraniofaciale medfødte anomalier såsom orofaciale kløfter, der oftest påvirker 1/800 fødsler alene i USA.En af de medfødte deformiteter8.
Delaminering af CNCC falder sammen med lukningen af ​​det forreste neuralrør mellem 8,5 og 9,5 dages embryonal udvikling hos mus.Mutanter af en række muse-orofaciale spalte-associerede gener udviser også en form for neuralrørsdefekt, herunder Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 og Pdgfrα12.Processerne med neuralrørslukning og CNCC-stratificering kan dog betragtes som uafhængige, da Splotch-mutantmusen (Pax3) udviser defekter i neuralrørslukningen uden nogen effekt på CNCC-stratificering eller migration 13,14.Yderligere musemodeller med defekter i CNCC-dissektion og neuralrørslukning vil hjælpe med at afgrænse det fælles molekylære grundlag for disse to processer.
Isolering af CNCC fra neuroepitelceller kræver opløsning af adhæsive junctions (AJ'er), som er sammensat af proteinkomplekser indeholdende blandt andet E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin og α-actinin forbundet med actin filamenter 2 Overekspressionsundersøgelser E-cadherin i neurale folder viste en reduktion eller forsinkelse i CNCC-delaminering.Omvendt resulterer undertrykkelse af E-cadherin i tidlig stratificering15,16.Mange af de faktorer, der medierer EMT under CNCC-stratificering, er transkriptionsfaktorer (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) og ekstracellulær matrix (ECM) remodeling-proteiner såsom matrixmetalloproteinaser (MMP'er), men CNCC'er er direkte cytoskeletale AJ-regulatorer endnu ikke kendt.PI3K-AKT-vejen er kendt for at antagonisere E-cadherin-niveauer, hovedsageligt fra kræftforskning17.Nylige undersøgelser har vist, at tab af PDGFα-baseret PI3K-AKT-signalering i mus fører til kraniofaciale abnormiteter, herunder ganespalte og neuralrørsdefekter12.Forholdet mellem PI3K-AKT-vejen og AJ-stabilitet ved CNCC-stratificering er imidlertid uklart.
Vi har tidligere identificeret SPECC1L som det første mutante gen hos to personer med en alvorlig spalte, der strækker sig fra munden til øjet, kendt som skrå spalte (ObFC) eller Tessier IV18 spalte.SPECC1L-mutationer er blevet identificeret i to multigenerationelle familier med det autosomale dominante Opitz G/BBB-syndrom (OMIM #145410), hvor berørte individer udviste hyperdistance og læbe/ganespalte19, og i en familie med Tibi-overdistancesyndrom (OMIM #145420)20 .mere end halvdelen af ​​tilfældene af Opitz G/BBB-syndrom er X-bundet (OMIM #300000) og er forårsaget af mutationer i MID1-genet, som koder for protein 22 i det mikrotubuli-associerede celleskelet.Vi antager, at SPECC1L, også et protein forbundet med mikrotubuli og actin-cytoskelettet, kan mediere signalering, der kræves til actin-cytoskelet-ombygning under celleadhæsion og migration 18 .Gennem in vitro og in vivo undersøgelser beskriver vi nu SPECC1L som en ny regulator af AJ stabilitet gennem PI3K-AKT signalering.På cellulært niveau resulterede SPECC1L-mangel i et fald i niveauet af pan-AKT-proteinet og en stigning i den apikale-basale dispersion af AJ, som blev elimineret ved kemisk aktivering af AKT-vejen.In vivo viser Specc11-deficiente embryoner nedsat neuralrørslukning og reduceret CNCC-dissektion.Således fungerer SPECC1L i stærkt reguleret celleadhæsionsbaseret signalering, der kræves til normal CNCC-funktion under ansigtsmorfogenese.
For at karakterisere rollen som SPECC1L på celleniveau brugte vi den tidligere beskrevne stabile osteosarkomcellelinje U2OS, der mangler SPECC1L18.Disse stabile U2OS-celler med SPECC1L (kd) knockdown havde et moderat (60-70 %) fald i niveauerne af SPECC1L-transkripter og proteiner sammen med defekter i migration og reorganisering af actincytoskelettet 18. I modsætning hertil var et alvorligt forbigående fald i SPECC1L har vist sig at føre til mitotiske defekter 23 .Efter yderligere karakterisering fandt vi ud af, at vores stabile SPECC1L-kd-celler ændrede morfologi ved en meget høj grad af konfluens (figur 1).Individuelle kontrolceller og kd-celler ved lav konfluens så ens ud (figur 1A, D).24 timer efter fusion bevarede kontrolceller deres kubiske form (fig. 1B, E), mens SPECC1L-kd-celler forlængede (fig. 1C, F).Omfanget af denne ændring i celleform blev fanget ved in vivo levende billeddannelse af kontrolceller og kd-celler (film 1).For at bestemme SPECC1L's rolle i konfluente celler undersøgte vi først dets ekspression.Vi fandt, at SPECC1L-proteinniveauer steg ved fusion (figur 1G), hvorimod SPECC1L-transkriptniveauer ikke steg (figur 1H).Efterhånden som celletætheden steg, akkumulerede SPECC1L-proteinet desuden ved intercellulære grænser (fig. 2A-E), med et mønster, der overlapper mønsteret for membranassocieret β-catenin (fig. 2A'-E').I betragtning af associationen af ​​SPECC1L med actin-cytoskelettet 18,23 antog vi, at SPECC1L interagerer med actin-baserede adhæsive junctions (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) celler forlænges ved høj konfluens (F) sammenlignet med kontrol U2OS celler (AC).Her er vist tre af de seks tidspunkter (T1, T3, T6), som vi valgte for forskellige celletætheder.(G) Western blot-analyse, der viser, at SPECC1L-proteinet er stabiliseret ved en høj grad af konfluens sammenlignet med en lav grad af konfluens i kontrolceller.Western blot af SPECC1L viser det forventede 120 kDa-bånd og et bånd med højere molekylvægt, muligvis post-translationelt modificeret (*).Western blot-analyse blev udført under de samme betingelser for lav og høj konfluens.Billeder, der viser SPECC1L ved lav og høj konfluens, blev taget fra det samme blot.Det samme blot blev fjernet og undersøgt igen med β-actin-antistof.(H) Kvantitativ RT-PCR-analyse viste ingen signifikante ændringer i SPECC1L-transkriptniveauer.Fejlbjælker repræsenterer SEM'er fra fire uafhængige eksperimenter.
(AE) Vi valgte seks tidspunkter (T1-T6), der repræsenterer en række celletætheder for at normalisere celleformanalyse og AJ-ændringer i U2OS-celler med SPECC1L knockdown (kd).De første fem af disse tidspunkter inkluderede enkeltceller (T1), 50-70 % fusion af små celleklynger (T2), fusion uden omformning af kd-celler (T3), omformning af kd-celler (T4) og 24 timers ændringer.i den posteriore form af kd (T5) celler.SPECC1L-proteinet blev overvejende spredt i cytoplasmaet ved T1 (A), men dets akkumulering blev observeret ved intercellulære grænser på efterfølgende tidspunkter (B-E, pile).(FJ) β-catenin viser lignende akkumulering ved intercellulære grænser forbundet med AJ-komplekset.(A'-E') SPECC1L og β-catenin viser overlappende farvning ved cellegrænser ved høj celletæthed (pile).(F'-J') I SPECC1L-kd-celler forekommer β-catenin-farvning normal ved lav celletæthed (F'-H'), men udvides efterhånden som celleformen ændres (I', J'; pile), hvilket indikerer, at AJ har ændret.Stænger = 10 µm.
Vi forsøgte derefter at bestemme effekten af ​​SPECC1L-mangel på AJ.Vi brugte flere AJ-associerede markører, herunder de kanoniske komponenter F-actin, myosin IIb, β-catenin og E-cadherin24,25,26,27.Actin-stressfibre steg i SPECC1L-kd-celler som beskrevet tidligere (fig. 3A,B) 18 .Myosin IIb forbundet med actinfilamenter viste en lignende stigning i SPECC1L-kd-celler in vitro (fig. 3C, D).AJ-associeret β-catenin binder til cadherin ved cellemembranen, hvilket viser et normalt "honningkage"-ekspressionsmønster i kontrolkubocytter (fig. 3E,G).Interessant nok viste β-catenin (fig. 3E, F) og E-cadherin (fig. 3G, H) farvning på cellemembranen af ​​sammenflydende SPECC1L-mangelfulde celler fremtrædende mønstre af forlænget farvning i flade billeder ved hjælp af konfokal mikroskopi.Denne udvidelse af AJ-associeret β-catenin-farvning i kd-celler var mest udtalt ved sammenløb, men så ud til at gå forud for ændringer i celleform (fig. 2F-J, F'-J').For at bestemme den fysiske natur af denne udvidede AJ-farvning undersøgte vi cellegrænser på den apikale-basale overflade af SPECC1L-kd U2OS-celler ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) (figur 3I, J).I modsætning til kontrolceller (fig. 3I), som havde separate elektrontætte områder, der indikerer AJ (pile), viste kd-celler (fig. 3J) store, sammenhængende områder med høj elektrontæthed, der indikerer AJ langs det apicobasale plan..Derudover observerede vi på tværgående snit omfattende cellemembranfoldninger i kd-celler (fig. S1A, B), hvilket forklarer det udvidede mønster af β-catenin og E-cadherin-farvningsbånd (fig. 3F, H).Til støtte for SPECC1L's rolle i AJ'er blev β-catenin co-immunpræcipiteret med SPECC1L i lysater af konfluente U2OS-celler (fig. 3K).Sammen med udvidet immunfarvning for AJ-markører var TEM-analyse i overensstemmelse med vores hypotese om, at SPECC1L-mangel øger AJ apikal-basal tæthed og varians.
(AH) Øget F-actin-farvning i kd-celler 48 timer efter fusion (T6; A, B).Ændret farvning af myosin IIb forbundet med F-actin (C, D).Det glatte mønster af β-catenin og E-cadherin membranfarvning i kontrolceller (E, G) blev forstærket i SPECC1L-kd (F, H) celler.Stænger = 10 µm.(I-J) Elektronmikrofotografier, der observerer det apikale-basale intercellulære kryds.Kontrolceller viser distinkte elektrontætte områder, der indikerer klæbrige kryds (I, pile).I modsætning hertil forekom hele den apikale-basale forbindelse i SPECC1L-kd-celler elektrontæt (J, pile), hvilket indikerer øget tæthed og spredning af klæbende forbindelser.(K) β-catenin blev co-immunpræcipiteret med SPECC1L i konfluente U2OS-cellelysater.Billede taget fra ét sted, der repræsenterer et af fire uafhængige eksperimenter.
For at forstå SPECC1L's rolle i kraniofacial morfogenese skabte vi en Specc1l-deficient musemodel ved hjælp af to uafhængige ES-fældecellelinjer, DTM096 og RRH048 (BayGenomics, CA), som repræsenterer intron 1 og Specc1l-transkripter blev fanget ved 15 (fig. 1). .4A, figur S2).Den genomiske placering af lokkevektor-insertet blev bestemt ved helgenomsekventering og bekræftet ved PCR (fig. S2).Begge genfælde-design tillod også in-frame-fusion af Specc11-lacZ-reportere ved indfangning.Derfor blev lacZ-ekspression bestemt ved X-gal-farvning brugt som en indikator for Specc11-ekspression.Begge alleler viste lignende lacZ-ekspressionsmønstre, hvor DTM096-genfælden i intron 1 viste stærkere ekspression end RRH048 i intron 15 (ikke vist).Specc1l er dog bredt udtrykt, med særligt stærkt udtryk i neurale folder ved E8.5 (Figur 4B), i neuralrøret og ansigtsprocesser ved E9.5 og E10.5 (Figur 4C,D) og i udviklende lemmer ved E10.5 og øjne (figur 4D).Vi har tidligere rapporteret, at SPECC1L-ekspression i den første pharyngeale bue ved E10.5 var til stede i epitelet og det underliggende mesenchyme18, i overensstemmelse med CNCC-afstamningen.For at teste SPECC1L-ekspression i CNCC udførte vi E8.5 neurale folder (Figur 4E-J) og E9.5 kraniesnit (Figur 4K-).Ved E8.5 farvede SPECC1L neurale folder intenst (fig. 4E, H), herunder celler farvet med NCC-markører (fig. 4G, J).Ved E9.5 farvede SPECC1L (fig. 4K, N) stærkt migrerende CNCC co-farvet med AP2A (fig. 4L, M) eller SOX10 (fig. 4O, P).
(A) Skematisk repræsentation af muse Specc11-genet, der viser lokkevektor-insertion i ES DTM096 (intron 1) og RRH048 (intron 15) cellekloner.(BD) lacZ-farvning af heterozygote Specc1lDTM096-embryoner, der repræsenterer Specc1l-ekspression fra E8.5 til E10.5.NE = neuroektoderm, NF = neural fold, PA1 = første svælgbue.(EP) SPECC1L-immunfarvning med NCC-markører AP2A og SOX10 i E8.5 (NF; EJ) neurale folder og E9.5 (KP) kraniesnit.SPECC1L-farvning blev i vid udstrækning observeret i neurale folder E8.5 (E, H; pilespidser), herunder celler mærket med AP2A (F, G; pilespidser) og SOX10 (I, J; pilespidser).Ved E9.5 farvede SPECC1L stærkt migrerende CNCC'er (K, N; pile) mærket AP2A (L, M; pile) og SOX10 (O, P; pile).
Krydsning mellem heterozygote Specc1lDTM096/+ og Specc1lRRH048/+ mus viser, at de to genfælde-alleler ikke er komplementære, og at sammensatte heterozygoter og embryonale homozygoter for begge genfælde-alleller er embryonale dødelige (tabel S1).Mendelske forhold indikerede et fald i overlevelsesraten for heterozygoter ved fødslen (forventet 1,34 vs. 2,0).Vi bemærkede lav perinatal dødelighed blandt heterozygoter, nogle havde kraniofaciale anomalier (fig. S3).Imidlertid gør den lave penetrance af disse perinatale kraniofaciale fænotyper det vanskeligt at studere deres underliggende patofysiologiske mekanismer.Derfor fokuserede vi på den embryonale dødelige fænotype af homozygote Specc11-mutanter.
De fleste sammensatte heterozygote eller homozygote Specc1lDTM096/RRH048 mutante embryoner udviklede sig ikke efter E9.5-10.5 (fig. 5A-D), og neuralrøret lukkede ikke anteriort (fig. 5B, D) og lukkede nogle gange bagtil (ikke vist) ..Denne kraniale neuralrørslukningsdefekt var forbundet med størstedelen af ​​CNCC-mærket DLX2, der forblev i neurale folderne ved E10.5, hvilket indikerer ingen dissektion (figur 5A'-D').For at bestemme, om den samlede størrelse af CNCC også blev reduceret, mærkede vi CNCC-linjer med GFP i vores genfælde-linjer med Wnt1-Cre og ROSAmTmG.Vi streamer sorteret GFP+ NCC og GFP- (RFP+) ikke-NCC fra hele embryoner.Ved E9.5 ændrede andelen af ​​flowsorterede GFP-mærkede CNCC'er sig ikke signifikant mellem WT og mutante embryoner (ikke vist), hvilket indikerer normal CNCC-specifikation.Derfor antog vi, at resterende Wnt1-Cre- og DLX2-farvning i udsatte neurale folder (figur 5B') skyldtes defekt CNCC-lag, muligvis på grund af øget tæthed eller spredning af AJ-celler, som det ses i SPECC1L-kd-celler.Vi brugte NCC-markørerne SOX10, AP2A og DLX2 til at bekræfte tilstedeværelsen af ​​CNCC i den neurale fold (figur 5E-R).Ved E8.5 blev neural fold-farvning for alle tre NCC-markører observeret i sektioner af WT (fig. 5E, G, I) og Speccll-mutant (fig. 5F, H, J).Ved E9.5, mens NCC-markører farvede migrerende NCC i WT-sektioner (fig. 5M, O, Q), blev resterende NCC-farvning observeret i eksponerede neurale folder af Speccll mutante embryoner (fig. 5N, P, R).Fordi SOX10 og DLX2 markerer migrerende CNCC'er, tyder dette resultat på, at SPECC1L-mangelfulde CNCC'er opnår post-migratoriske specifikationer, men undlader at migrere fra neurale folder.
Specc11-mangel fører til defekt neuralrørslukning, delaminering af kraniale neurale crestceller og AJ'er.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryobærende migrerende kraniale neurale kamceller (CNCC) mærket med Wnt1-Cre (A').I modsætning hertil viser Specc11 mutante embryoner åbne neurale folder (B), pilespidser) og CNCC'er, der ikke er migreret (B', pilespidser).(C, D') Lysfeltbilleder (C, D') og immunfarvning (C', D') af CNCC-markøren DLX2 af E10.5 WT-embryoner (C, C') og Specc1l (D, D').I WT E10.5 embryoner koloniserer DLX2-positive CNCC gællebuerne (C', pile), mens i mutanter fortsætter iøjnefaldende farvning i de åbne neurale folder (D', pile) og i de første svælgbuer (D', pile).) med nogen farvning (pile), der indikerer dårlig delaminering og migration af CNCC.ER) Sektioner af WT- og Specc1l-mutante embryoner i trin E8.5 (E-L) og E9.5 (M-R) blev mærket med NCC-markører SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) og DLX2 (I, J, Q, R).Ved E8.5 blev NCC-farvning observeret i vildtype neurale fold (NF) og mutante sektioner.Co-farvning af SOX10 og β-catenin i E8.5 WT (K) og mutant (L) afslørede øget β-catenin-farvning ved cellegrænser i neurale folder.Ved E9.5 blev vildtypefarvning af migrerende CNCC'er (M, O, Q) observeret, mens ustratificerede CNCC'er i mutanter farvede åbne neurale folder (N, P, R).(S-Z) In vivo AJ-mærkningsanalyse i koronale sektioner af WT- og Specc11DTM096/RRH048-embryoner med E9.5-mutationen.Et omtrentligt snitplan er vist i øverste højre hjørne.I sektioner af mutant væv blev øget farvning af F-actin (S, T) og myosin IIb (U, V) observeret.I lighed med in vitro-resultaterne i fig. 3 blev der i mutante embryoner observeret forbedret membranfarvning for β-catenin (W, X) og E-cadherin (Y, Z).(AA-BB) Et elektronmikrofotografi af et udsnit af et vildtype-embryo, der ser ud over grænsen til den apikale-basale celle, viser en tydelig elektrontæt region, der indikerer adhæsive junctions (AA, pile).I modsætning hertil, i sektioner af Specc11 mutante embryoner (BB, pile), er hele den apicobasale forbindelse elektrontæt, hvilket indikerer en øget tæthed og spredning af adhæsive forbindelser.
For at teste vores hypotese om, at reduceret lagdeling skyldes ændret AJ, undersøgte vi AJ-mærkning i udsatte neurale folder af Specc1l mutante embryoner (fig. 5S-Z).Vi observerede en stigning i actin-stressfibre (fig. 5S, T) og en samtidig øget lokalisering af myosin IIB-farvning på actinfibre (fig. 5U, V).Det er vigtigt, at vi observerede øget farvning af β-catenin (fig. 5W, X) og E-cadherin (fig. 5Y, Z) ved intercellulære grænser.Vi undersøgte også β-catenin-farvning af NCC i neurale folderne af E8.5-embryoner (fig. 5K, L).β-catenin-farvning så ud til at være stærkere i Specc1l mutante neurale folder (fig. 5L og K), hvilket tyder på, at AJ-ændringer var begyndt.I elektronmikrofotografier af kraniesnit af E9.5-embryoner observerede vi igen øget diffus elektrontæt farvning i Specc1l-mutantembryoner sammenlignet med WT (fig. 5AA, BB og S1E-H).Tilsammen understøtter disse resultater vores in vitro-resultater i SPECC1L-kd U2OS-celler og antyder, at afvigende AJ-farvning går forud for CNCC-stratificering i vores mutante embryoner.
I betragtning af det kendte antagonistiske forhold mellem AKT-aktivitet og E-cadherin-stabilitet, 17,28 antog vi en hypotese om involvering af PI3K-AKT-signalering.Derudover observerede vi subepidermal blæredannelse i nogle af vores mutante embryoner, der undslap dødelighed (<5%) ved E9.5-10.5 og i stedet slog sig ned på omkring E13.5 (fig. S3).Subepidermale vesikler er et kendetegn for reduceret PI3K-AKT-signalering baseret på PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) rapporterede, at afbrydelse af PDGFRα-baseret PI3K-aktivering i PdgfraPI3K/PI3K mutante embryoner resulterer i subepidermale vesikler, neuralrørsdefekter og ganespalte fænotyper.Faktisk blev niveauer af pan-AKT og aktivt phosphoryleret Ser473-AKT reduceret in vivo i Speccll mutantvæv til E9.5 embryonal standsning (fig. 6A-D).Faldet i niveauer af phosphoryleret Ser473-AKT kan udelukkende skyldes faldet i niveauer af pan-AKT in vivo (FIG. 6E) og in vitro (FIG. 6F).Et in vitro fald blev kun observeret, når U2OS-celler var stærkt sammenflydende med ændringer i celleform og AJ-densitet (figur 6D).Vores data tyder således på, at SPECC1L er en ny positiv regulator af PI3K-AKT-signalering i kraniofacial morfogenese.
(A–E) E8.5 (A,B) og E9.5 (C,D) kraniesnit eller E9.5 lysater fra Specc1l mutante embryoner (E), der viser niveauer af aktivt phosphoryleret S473-AKT og pan-AKT Proteinreduktion sammenlignet med kontrol WT.Western blotting blev udført på vildtypelysater og mutantlysater under de samme betingelser.Billederne vist for SPECC1L blev taget fra en blot.Det samme blot blev fjernet og undersøgt igen med anti-pan-ACT og β-actin antistoffer.Pan-AKT niveauer i E8.5 neurale folder (A, B) og niveauer af phosphoryleret S473-AKT i E9.5 kranie sektioner blev signifikant reduceret.(F) Pan-AKT-niveauer blev tilsvarende reduceret i lysater af SPECC1L-kd U2OS-celler høstet ved høj konfluens.Fejlbjælker repræsenterer SEM'er fra tre uafhængige Western blot-kvantificeringer.(GJ) Sektioner af WT-embryoner ved E9.5 farvet med henholdsvis KI67 og spaltet caspase 3, der viser celleproliferation (G, G') og lille apoptotisk aktivitet (H, H').Specc11 mutante embryoner viser sammenlignelig celleproliferation (I), men antallet af celler, der gennemgår apoptose, er signifikant forøget (J).
Vi undersøgte derefter markører for spredning og apoptose.Vi observerede ingen forskel i proliferationen af ​​E9.5-embryoner (fig. 6E, G sammenlignet med I) med et proliferationsindeks på 82,5 % for WT-mutanter og 86,5 % for Specc1l-mutanter målt ved KI67-farvning (p <0,56, Fisher's nøjagtig test).Tilsvarende observerede vi ingen forskel i apoptose målt ved farvning for spaltet caspase 3 i neurale folder ved E8.5 indtil embryostandsning (ikke vist) (ikke vist).I modsætning hertil var apoptose signifikant øget i alle E9.5 mutante embryoner (fig. 6F, H og J).Denne samlede stigning i apoptose er i overensstemmelse med reduceret PI3K-AKT-signalering og tidlig embryonal dødelighed29,30,31.
Dernæst for at bekræfte en kausal rolle for PI3K-AKT-signalering i AJ-ændringer i vores kd-celler, ændrede vi kemisk vej i kontrol- og kd-celler (figur 7A-F).Vi brugte som markør celleformændringsfænotypen observeret i konfluente SPECC1L-kd-celler, som vi kvantificerede ved hjælp af forholdet mellem den længste dimension (længde) og den tilsvarende lodrette dimension (bredde).Et forhold på 1 forventes for relativt runde eller kubiske celler (figur 7G).Ud over celleform bekræftede vi også virkningen på AJ ved β-catenin-farvning (fig. 7A'-F').Inhibering af PI3K-AKT-vejen under anvendelse af wortmannin var tilstrækkelig til at ændre celleform i kontrolceller (figur 7A, C) og AJ (figur 7A').PI3K-AKT-aktivator SC-79 påvirkede ikke celleform (FIG. 7A, E) eller AJ-ekspansion (FIG. 7A') i kontrolceller.I SPECC1L-kd-celler resulterede yderligere undertrykkelse af PI3K-AKT-vejen i øget apoptose (fig. 7B, D) og en markant stigning i β-catenin-farvning (fig. 7B'), i overensstemmelse med vores in vivo tunge mutanter.Det er vigtigt, at aktivering af PI3K-AKT-vejen forbedrede celleformen signifikant (figur 7B, F) og AJ-fænotyper (figur 7B").Ændringer i celleform blev kvantificeret som cellerundhedsforhold (CCR) og sammenlignet for signifikans som beskrevet ovenfor (FIG. 7G).Faktisk var wortmanninbehandling i kontrolceller (fig. 7G, CCR = 1,56) tilstrækkelig til signifikant at ændre celleformen (fig. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) i samme grad som den observerede i SPECC1L.-kd-celler (fig. 7G, CCR = 3,46).Wortmanninbehandling af SPECC1L-kd-celler (fig. 7G, CCR = 3,60, ubetydelig) var ikke mere signifikant end ubehandlede kd-celler (fig. 7G, CCR = 3,46, ubetydelig) eller wortmanninbehandlede kontrolceller (fig. 7G)., CCR = 3,46, ubetydelig) påvirker desuden celleforlængelsen (7G, CCR = 3,61, ubetydelig).Vigtigst er det, at SC-79 AKT-aktivator genoprettede den forlængede fænotype af SPECC1L-kd-celler (fig. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Disse resultater bekræfter, at SPECC1L regulerer PI3K-AKT-signalering og tyder på, at et moderat fald i SPECC1L påvirker celleadhæsion, mens et stærkt fald fører til apoptose (fig. 8).
(A–F') Kontrol (A, C, E) og SPECC1L-kd (B, D, F) celler behandlet med PI3K-AKT pathway inhibitor wortmannin (C, D) eller SC-79 aktivator (E, F) behandling .Ubehandlede kontrolceller er kubiske (A) med normal β-cat-cellulær farvning (A'), mens kd-celler er forlængede (B) med øget β-cat-farvning (B').Efter undertrykkelse af PI3K-AKT-vejen forlængede kontrolcellerne sig (C) med β-kat-ekspansion (C'), mens kd-celler begyndte at gennemgå apoptose (D), svarende til vores stærkt muterede embryoner og viste ekstremt forbedret β-kat.farvning (D').Efter aktivering af PI3K-AKT-vejen forblev kontrolcellerne kubiske (E) og havde normal β-cat (E')-farvning, mens kd-celler viste signifikant forbedret celleform (F) og β-cat (F') farvning, hvilket indikerer (G) Graden af ​​celleformændring i (AF) blev kvantificeret ved hjælp af cellerundhedsforholdet (CCR) af den længste dimension (længde) og den tilsvarende lodrette dimension (bredde) ved hjælp af MetaMorph-software.Ubehandlede (NT) SPECC1L-kd-celler (CCR = 3,46) var signifikant længere end kontrolceller (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10-13).Worts inhibering af PI3K-AKT-vejen i kontrolceller var tilstrækkelig til at forårsage en lignende forlængelse i celleform (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Tilsvarende genoprettede AKT-aktivering af SC-79 i SPECC1L-kd-celler celleforlængelse til kontrolniveauer (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Wortmanninbehandling af SPECC1L-kd-celler resulterede i øget apoptose, men ingen yderligere stigning i celleformændring (CCR=3,60) sammenlignet med ubehandlede kd (CCR=3,46, ns) eller wortmannin-behandlede kontrolceller (3,61) observeret i .ns = betyder ikke noget.+/- SEM-målinger for 50 celler er vist.Statistiske forskelle blev beregnet ved hjælp af Students t-test.
(A) Skematisk repræsentation af hæmning og aktivering af PI3K-AKT-vejen, hvilket resulterer i henholdsvis AJ-ændringer og redning.(B) Foreslået model for AKT-proteinstabilisering ved SPECC1L.
Præmigratoriske CNCC'er kræver AJ-lyse for at adskille fra forreste neurale fold neuroepitelceller1,15,32.Øget farvning af AJ-komponenter og tab af den apikale-basale AJ asymmetriske fordeling i SPECC1L-deficiente celler både in vitro og in vivo, kombineret med den fysiske nærhed af SPECC1L til β-catenin, tyder på, at SPECC1L fungerer til korrekt at opretholde AJ lokal stabilitet for organisations muskler.actin cytoskelet.Associationen af ​​SPECC1L med actincytoskelettet og β-catenin og stigningen i antallet af kondenserede actinfilamenter i fravær af SPECC1L er i overensstemmelse med den observerede stigning i AJ-densitet.En anden mulighed er, at et øget antal actinfibre i SPECC1L-deficiente celler fører til en ændring i intercellulær spænding.Fordi cellulær stress påvirker AJ 33-dynamikken, kan spændingsændringer resultere i mere diffus AJ 34.Så eventuelle ændringer vil påvirke CNCC-lagene.
Wnt1 udtrykkes i de tidlige neurale folder, der giver anledning til neurale crestceller.Således markerer Wnt1-cre afstamningssporing både præ- og migrerende NCC35.Men Wnt1 markerer også dorsal hjernevæv kloner også afledt af tidlige neurale folder 35,36, hvilket gør det sandsynligt, at vores farvning af E9.5 mutanter for Wnt1 markører i åbne neurale folder ikke er CNCC.Vores positive farvning for NCC-markørerne AP2A og SOX10 bekræftede, at de udsatte neurale folder af Specc11-mutante embryoner faktisk indeholdt CNCC.Da AP2A og SOX10 er markører for tidligt migrerende NCC, indikerede positiv farvning, at disse celler er post-migratoriske CNCC, som ikke kan stratificeres af E9.5.
Vores data tyder på, at molekylær regulering af AJ af SPECC1L er medieret af PI3K-AKT-signalering.AKT-signalering er reduceret i SPECC1L-mangelfulde celler og væv.Fund af Fantauzzo et al.understøtte en direkte rolle for PI3K-AKT-signalering i kraniofacial morfogenese.(2014) viste, at manglen på aktivering af PDGFRα-baseret PI3K-AKT-signalering fører til en ganespalte-fænotype.Vi viser også, at inhibering af PI3K-AKT-vejen er tilstrækkelig til at ændre AJ og celleform i U2OS-celler.I overensstemmelse med vores resultater, Cain et al.37 viste, at nedregulering af PI3K α110-underenheden i endotelceller resulterer i en lignende stigning i pericellulær β-catenin-farvning, omtalt som en stigning i "forbindelsesindekset".Men i endotelceller, hvis actinfilamenter allerede er meget organiserede, resulterer undertrykkelse af PI3K-AKT-vejen i en løs celleform.I modsætning hertil viste SPECC1L-kd U2OS-celler en aflang celleform.Denne forskel kan være celletypespecifik.Mens undertrykkelse af PI3K-AKT-signalering permanent påvirker actincytoskelettet, bestemmes effekten på celleform af ændringer i spænding forårsaget af ændringer i tætheden og organiseringen af ​​centrale actinfibre.I U2OS-celler brugte vi kun celleformændringer som en markør for SPECC1L-deficient AJ-ændring og genopretning.Som konklusion antager vi, at inhibering af AKT-vejen i SPECC1L-mangel øger AJ-stabiliteten og reducerer delaminering i CNCC.
Interessant nok blev pan-AKT-niveauer reduceret in vitro og in vivo ud over phosphorylerede 473-AKT-niveauer i fravær af SPECC1L, hvilket tyder på regulering af PI3K-AKT-signalering på niveauet for AKT-proteinstabilitet eller -omsætning.SPECC1L- og MID1-generne, begge forbundet med Opitz/GBBB-syndrom, koder for proteiner, der stabiliserer mikrotubuli 18,22.Mekanismen, hvorved SPECC1L og MID1 medierer mikrotubulistabilisering, er ikke fuldt ud forstået.I tilfælde af SPECC1L inkluderer denne stabilisering øget acetylering af en undergruppe af mikrotubuli 18 .Det er muligt, at SPECC1L bruger en lignende mekanisme til at stabilisere andre proteiner såsom AKT.Det er blevet vist, at acetylering af lysinrester i AKT-proteinet fører til et fald i membranlokalisering og phosphorylering38.Derudover er ubiquitinering af K63-kæden ved den samme lysinrest på AKT påkrævet for dens membranlokalisering og aktivering39,40.Blandt flere faktorer, der interagerer med SPECC1L-proteiner, identificeret i forskellige højkapacitetsgær-to-hybridscreeninger, er fire – CCDC841, ECM2942, APC og UBE2I43 – blevet impliceret i proteinomsætning eller stabilitet via ubiquitinering eller sumoylering.SPECC1L kan være involveret i post-translationel modifikation af AKT-lysinrester, hvilket påvirker AKT-stabiliteten.Den kritiske rolle for SPECC1L i lokaliseringen og stabiliteten af ​​AKT-proteinet mangler dog at blive belyst.
Alvorlige defekter i SPECC1L-ekspression in vivo resulterede i øget AJ-markørfarvning og defekt CNCC-overlejring samt øget apoptose og tidlig embryonal dødelighed.Tidligere rapporter har vist, at musemutanter med øgede niveauer af apoptose er forbundet med neuralrørsdefekter 44,45,46,47 og kraniofaciale defekter48.Det er blevet foreslået, at overdreven celledød i neurale folder eller svælgbuer kan resultere i et utilstrækkeligt antal celler, der kræves til korrekt morfogenetisk bevægelse 48,49,50.I modsætning hertil viste vores SPECC1L-mangelfulde cellelinjer med moderat reduceret SPECC1L-ekspression kun AJ-ændringer uden tegn på øget celledød.Kemisk hæmning af PI3K-AKT-vejen i disse Kd-celler resulterede imidlertid i øget apoptose.Således sikrer et moderat fald i SPECC1L-ekspression eller funktion celleoverlevelse.Dette er i overensstemmelse med observationen af, at sjældne Specc11-mutante embryoner, der undslipper arrest ved st.E9.5 - måske på grund af reduceret genindfangningseffektivitet - er i stand til at lukke deres neuralrør og stoppe senere i udviklingen, ofte med kraniofaciale defekter (Fig. S3).Også i overensstemmelse hermed er den sjældne forekomst af heterozygote Specc1l-embryoner med kraniofaciale abnormiteter – sandsynligvis på grund af øget genindfangningseffektivitet – samt fundet hos zebrafisk, hvor en af ​​de to SPECC1L-ortologer (specc1lb) forårsager sene embryonale fænotyper, herunder tab af underkæber og bilaterale kløfter51.Således kan heterozygote SPECC1L-tab-af-funktionsmutationer identificeret hos humane patienter forårsage små svækkelser i SPECC1L-funktionen under kraniofacial morfogenese, tilstrækkeligt til at forklare deres orofaciale kløfter.SPECC1L-baseret regulering af intercellulære kontakter kan også spille en rolle i palatogenese og fusion af pharyngealbuerne.Yderligere undersøgelser af SPECC1L-funktion vil hjælpe med at belyse rollen af ​​midlertidige intercellulære kontakter i CNCC under neuralrørslukning i neuroepitelcellemotilitet og kraniofacial morfogenese.
U2OS osteosarkom kontrol og SPECC1L-kd celler er blevet beskrevet tidligere (Saadi et al., 2011).Antistoffer mod SPECC1L er også blevet karakteriseret tidligere (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin antistoffer (kanin; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mus; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Californien), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), spaltet caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) og β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev anvendt som beskrevet..Actinfilamenter blev farvet med Acti-farve rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS-kontrolceller og SPECC1L-kd-celler blev dyrket i standard højglucose DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies, Carlsbad, CA).Til AJ-ændringer blev 2 x 105 celler podet på glas behandlet med 0,1 % porcin gelatine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og observeret for ændringer i celleform.Celler blev opsamlet på forskellige angivne tidspunkter: 4 timer efter podning (t = 1), 24 timer efter podning (t = 2), sammenløb uden ændring i celleform (t = 3), ændring i celleform (t = 4) 24 timer efter celleformændring (t = 5) og 48 timer efter celleformændring (t = 6) (fig. 1, 2, 3).For at modulere PI3K-AKT-vejen blev celler dyrket i de angivne koncentrationer med PI3K-AKT-hæmmeren wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) eller SC-79-aktivator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Mediet indeholdende kemikalierne blev skiftet dagligt.
Ramme-for-ramme-optagelser blev foretaget på levende kontrol- og KD-celler under normale dyrkningsbetingelser, og fasekontrastbilleder blev opsamlet hvert 10. minut i 7 dage.Billeder blev erhvervet ved hjælp af et computerstyret Leica DM IRB inverteret mikroskop udstyret med en mekanisk scene og et 10 × N-PLAN objektiv forbundet til et QImaging Retiga-SRV kamera.Under billeddannelse blev cellekulturer holdt ved 37°C i en fugtig atmosfære med 5% CO2.
To genfælde ES-cellelinjer DTM096 og RRH048 fra Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) blev brugt til at generere Specc11-deficiente muselinjer, betegnet Specc1lgtDTM096 og Specc1lgtRRH046.Kort fortalt blev 129/REJ ES-celler injiceret i C57BL6-blastocyster.De resulterende kimære hanmus blev avlet med C57BL6 hunmus for at identificere afkom med agouti-pelsfarve.Tilstedeværelsen af ​​genfælde-vektor-inserts blev brugt til at identificere heterozygoter.Mus blev holdt på en blandet baggrund af 129/REJ;C57BL6.Placeringen af ​​insertionsstedet for den genetiske fældevektor blev bekræftet ved RT-PCR, genomsekventering og genetisk komplementering (Supplerende figur 1).For at spore CNCC-afstamningen af ​​dobbelte heterozygote Specc1lGT-mus, blev ROSAmTmG (#007576) og Wnt1-Cre (#003829) mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) krydset for at producere ROSAmTmG- og Wnt1-Cre-allelen i Specc1-Cre-embryol.Alle eksperimenter med mus blev udført i henhold til protokoller godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Kansas Medical Center.
Embryoer blev fikseret i (1 % formaldehyd, 0,2 % glutaraldehyd, 2 mM MgCl2, 0,02 % NP-40, 5 mM EGTA) i 60 minutter ved stuetemperatur.Efter fiksering i X-gal-farvningsopløsning (5 mM kaliumferricyanid, 5 mM kaliumferrocyanid, 2 mM MgCl2, 0,01% natriumdeoxycholat, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) blev farveudvikling udført ved 37°C .°C inden for 1-6 timer.Embryoer blev postfikseret i 4% PFA og visualiseret.
Til Western blotting blev celler lyseret i passiv lysisbuffer (Promega, Fitchburg, WI) suppleret med en blanding af HALT-proteaseinhibitorer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysater blev behandlet på 12% polyacrylamid Mini-PROTEAN TGX færdige geler (Bio-Rad, Hercules, CA) og overført til Immobilon PVDF-membraner (EMD Millipore, Billerica, MA).Membranerne blev blokeret i 5 % mælk i PBS indeholdende 0,1 % Tween.Antistoffer blev inkuberet natten over ved 4°C eller i en time ved stuetemperatur.Femto SuperSignal West ECL-reagens (Thermo Scientific, Waltham, MA) blev brugt til signalgenerering.Til immunfarvning blev embryoner fikseret natten over i 4% PFA/PBS og kryokonserveret.Vævskryosektioner blev blokeret i PBS indeholdende 1 % normalt gedeserum (Thermo Scientific, Waltham, MA) og 0,1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og derefter inkuberet ved 4°C i en inkubator under nat.med anti-antistof og fluorescerende sekundært antistof (1:1000) i 1 time ved 4°C.Farvede snit blev anbragt i ProLong guldmedium (Thermo Scientific, Waltham MA), og flade billeder blev opnået ved anvendelse af et Leica TCS SPE konfokalmikroskop.Hver immunfarvning blev udført som tre uafhængige eksperimenter på tværsnit af mindst to mutante embryoner.Et repræsentativt eksperiment er vist.
Celler blev inkuberet i modificeret RIPA-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % NP-40, 130 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM EDTA og HALT-proteaseinhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Kort fortalt blev lysater foroprenset med protein G magnetiske perler (Life Technologies, Carlsbad, CA) og derefter inkuberet natten over ved 4°C. med anti-SPECC1L eller IgG protein G-proteinperler blev brugt til at ekstrahere SPECC1L, og Western blotting blev udført under anvendelse af anti-SPECC1L eller IgG protein. -β-catenin antistof beskrevet ovenfor. De viste co-IP eksperimenter er repræsentative for fire uafhængige eksperimenter.
Fixerede dyrkede celler eller embryonale musevæv blev leveret til elektronmikroskopicentret ved University of Kansas Medical Center.Kort fortalt blev prøver indlejret i EMbed 812-harpiks (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymeriseret natten over ved 60°C og sektioneret ved 80 nm under anvendelse af en Leica UC7 ultramikrotom udstyret med en diamantklinge.Sektioner blev visualiseret ved anvendelse af et JEOL JEM-1400 transmissionselektronmikroskop udstyret med en 100 kV Lab6 pistol.
Sådan citeres denne artikel: Wilson, NR et al.Mangel på SPECC1L fører til øget stabilitet af splejsede led og reduceret delaminering af kraniale neurale kamceller.videnskaben.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induktion og differentiering af den neurale kam.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Kraniale neurale kamceller i bevægelse: deres rolle i kraniofacial udvikling.American Journal of Medical Genetics.Del A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurokristopathia: dens vækst og udvikling over 20 år.Børnelæge.patologi.laboratorium.medicin.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU og Noten MM Gennembrud i genetik af orofaciale kløfter.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. og Riley, FM Molekylære mekanismer for kraniel neural crest cell migration og mønsterdannelse under kraniofacial udvikling.Udvikling 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH og Murray, JK Læbe-ganespalte: forståelse af genetiske og miljømæssige påvirkninger.naturlig kommentar.Genetics 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Unormal morfogenese af hud, lemmer og kraniofaciale region i interferon-regulerende faktor-6 (Irf6)-deficiente mus.National Genette.38, 1335-1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominante mutationer i GRHL3 forårsager van der Waord syndrom og hæmmer udviklingen af ​​den orale periderm.Am J Hum Genet 94, 23-32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ og Juriloff, DM Opdater listen over musemutanter med defekter i neuralrørslukning og fremskridt hen imod en komplet genetisk forståelse af neuralrørslukning.Udredning af fødselsdefekter.Del A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-medieret PDGFRalpha-signalering regulerer overlevelse og proliferation i skeletudvikling gennem en p53-afhængig intracellulær vej.Genudvikling 28, 1005-1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND og Murdoch, JN Disheveled: Forholdet mellem konvergent ekspansion og neuralrørslukning.Tendenser inden for neurologi.26, 453-455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).