347 rustfrit stål oprullet rør kemisk komponent, identifikation af nye interferon-responsive humane leukocytantigen-A (HLA-A) chaperoneproteiner ved hjælp af tværbundet massespektrometri (CLMS)

Tak fordi du besøgte Nature.com.Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).For at sikre løbende support viser vi desuden siden uden styles og JavaScript.
Sliders, der viser tre artikler pr. slide.Brug tilbage- og næste-knapperne til at flytte gennem diasene, eller dias-controllerknapperne i slutningen til at flytte gennem hvert dias.

Produkt beskrivelse

Rustfrit stål 347L spolerør, stålkvalitet: SS347L

Interferon-signalsystemet inducerer et stærkt cytokin-respons på en lang række patogene og iboende patologiske signaler fra miljøet, hvilket resulterer i induktion af undergrupper af interferon-inducerbare proteiner.Vi anvendte DSS-medieret tværbindingsmassespektrometri (CLMS) for at detektere nye protein-protein-interaktioner i domænet af interferon-inducerede proteiner.Ud over de forventede interferon-inducerbare proteiner identificerede vi også nye intermolekylære og intramolekylære tværbundne addukter af kanoniske interferon-inducerbare proteiner såsom MX1, USP18, OAS3 og STAT1.Vi fokuserede på ortogonal validering af et nyt sæt interferon-inducerbare proteinnetværk dannet af HLA-A-proteiner (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ved hjælp af co-immunpræcipitation og deres yderligere undersøgelse ved hjælp af molekylær dynamikmodellering.Modellering af proteinkompleksets konformationelle dynamik afslørede flere interaktionssteder, der afspejlede interaktionerne identificeret i CLMS-resultaterne.Sammen præsenterer vi et pilotstudie af CLMS for at identificere nye signalkomplekser induceret af interferon og ser frem til den bredere brug af CLMS til at identificere ny dynamik af proteininteraktioner i tumormikromiljøet.
Før et adaptivt immunrespons begynder, igangsætter værtens medfødte forsvarssystem et antimikrobielt respons medieret af en familie af udskilte alfa-spiralformede cytokiner kaldet interferoner (IFN'er).Type I IFN-klasserne IFNa og IFNβ aktiverer cellulære responser, herunder antivirale, proapoptotiske, proinflammatoriske og antiproliferative tilstande.Hos mennesker kendes 13 undertyper af IFNa, alle samlet på kromosom 91. Overraskende nok er kun IFNa2 blevet undersøgt til klinisk brug.For nylig er der blevet lagt særlig vægt på forskning i andre undertyper af IFNa.En nylig undersøgelse viste, at IFNa14 er en af ​​de mest effektive isoformer til at begrænse HBV2 og HIV-13,4 replikation sammenlignet med den kanoniske IFNa2 subtype.
Det er blevet fastslået, at aktiverede type I interferonreceptorkomplekser (IFNAR1 og IFNAR2) udløser en signaltransduktionskaskade medieret af Janus-kinaserne TYK2 og JAK15,6.Disse Janus-kinaser phosphorylerer signaltransducere og transkriptionelle proteinaktivatorer (STAT1 og STAT2) på tyrosinrester for at initiere SH2-domænemedieret heterodimerisering6.Efterfølgende binder IRF9 STAT-heterodimerer for at danne et trimerisk kompleks af det IFN-stimulerede faktor 3-gen (ISGF3), som translokerer til kernen og inducerer transkriptionen af ​​over 2000 interferon-stimulerede gener (ISG'er)5,6,7,8.
ISG'er danner rygraden i det medfødte immunsystem, især som reaktion på viralt angreb.Som en første forsvarslinje mod viral infektion implementerer celler hurtigt omfattende interaktioner af cellulære proteiner med en bred vifte af biologiske aktiviteter.Disse proteiner inkluderer mønstergenkendelsesreceptorer, signalmolekyler, transkriptionsfaktorer og proteiner med direkte antivirale funktioner samt negative regulatorer af immunrespons9.Meget af informationen om ISG-aktivitet kommer fra funktionelle skærme, der anvender overekspressionsskærme10,11 eller gendæmpningsteknikker (siRNA, RNAi og CRISPR)12,13, hvor individuelle ISG'er udtrykkes eller hæmmes, og deres aktivitet testes på forskellige vira.Selvom disse undersøgelser har bestemt de antivirale egenskaber af individuelle ISG'er, forbliver de underliggende molekylære mekanismer for hver ISG stort set ukendte.Det er generelt accepteret, at mange proteiner interagerer med en eller flere cytokiner for at sikre fuld aktivitet, så enten interagerer ISG'er direkte eller deres interaktioner medieres af cellulære proteiner.For eksempel identificerede et nyligt fototværbundet proteomikstudie ATPase VCP/p97 som en vigtig IFITM3-interaktionspartner, hvis hæmning fører til defekter i lysosomal sortering, omsætning og cotransport af IFITM3 med virale partikler 14 .Ved hjælp af immunpræcipitation identificerede vi VAPA, et vesikelassocieret protein, som en interaktionspartner med IFITM1/2/3, der medierer kolesterol-medieret viral modning, og dette blev bekræftet af en anden undersøgelse ved hjælp af et gær-to-hybridsystem.Videnskabelig støtte 15, 16.
En fundamental biologisk proces involveret i undertrykkelsen af ​​infektion og malign transformation er antigenpræsentation, som medieres af major histocompatibility complex (MHC) molekyler.Peptider (8-12 aminosyrer lange) fra spaltede, for tidligt terminerede eller fejlfoldede proteiner indlæses i MHC-I-heterodimeren (bestående af MHC-I tunge og lette kæder, kaldet β-2-mikroglobulin; β2M) 17,18.De resulterende stabile MHC-I-trimerer transporteres til celleoverfladen, hvor de præsenterer intracellulære peptider til CD8+ T-celler (cytotoksiske T-celler)17.T-celler genkender og ødelægger disse patogener og celler, der bærer et tumorspecifikt antigen.Følgelig undertrykker patogener og tumorceller ofte antigenpræsentationsprocessen for at undgå immunovervågning.Derudover er MHC-I nedreguleret i 40-90 % af humane tumorer og er ofte forbundet med en dårligere prognose19.
Gener involveret i at reagere på patogener skal hurtigt skifte mellem en hviletilstand og en tilstand af aktiv transkription.Derfor antages flere cellulære proteiner at være involveret i svaret på høj IFN-efterspørgsel over korte perioder, herunder ombygning og modifikation af promotorkromatin 20,21.De fleste undersøgelser har fokuseret på identifikation af individuelle ISG-proteinpartnere i nærvær af IFN.Adskillige proteomiske og transkriptomiske undersøgelser i modelcellesystemer har belyst effekten af ​​IFN på det cellulære landskab.Men på trods af en voksende forståelse af dynamikken induceret af interferoner, ved vi stadig lidt om involvering af ISG'er.Når man overvejer kompleksiteten og den tidsafhængige dynamik af interferon-signalering, opstår to spørgsmål: (i) er det muligt at stabilisere og fange multiproteinkomplekserne involveret i hurtig signalering, og (ii) kan disse interaktioner kortlægges i 3D-rum?
For at løse disse problemer implementerede vi disuccinimid-suberat-medieret kemisk tværbinding (DSS) kombineret med massespektrometri (CLMS) for at studere det IFNa-inducerede proteininteraktionsnetværk og dets dynamik.DSS tilføjer kovalente bindinger mellem proksimale rester af proteiner og/eller proteinkomplekser in vivo.Efterfølgende MS-analyse afslører specifikke tværbindingssteder, der afspejler den rumlige nærhed af regioner inden for et bestemt protein, kaldet interne bindinger eller underenheder i proteinkomplekser, kaldet indbyrdes forhold.Ved hjælp af denne tilgang har vi identificeret flere nye protein-proteinkomplekser såvel som interferon-inducerede multiprotein-interaktionsnetværk.Ved yderligere at teste en undergruppe af disse nye interaktioner demonstrerer vi, at H2BFS (H2B histon-type FS; herefter benævnt H2B) og MDN1 fungerer som bindingspartnere for HLA-A.
Flo-1-celler er en af ​​de bedst kendte in vitro-modeller af esophageal adenocarcinom, da de efterligner nøgletræk ved esophageal tumorer22,23.Imidlertid er ikke alle tumorer immunogene, og for at bestemme, om Flo-1-celler reagerer på interferonbehandling, behandlede vi Flo-1-celler med 10 ng/ml IFNa i 72 timer.Flo-1-celler viste tidlig induktion af pSTAT1 og IRF1, startende 2 timer efter behandling og fortsatte i 72 timer, med et tidsafhængigt fald i stationære niveauer af IRF1 (figur 1A).ISG'er (MX1, IFITM1, OAS1/2 og ISG15) viste sig at være stærkt induceret efter 6 timer, hvilket efterligner de klassiske midt- og senfaseresponser på IFNa (figur 1A).Sammen tyder disse data på, at denne cellulære model kan bruges til at studere interferonresponser.
Differentielle proteinekspressionsresponser i Flo-1-celler efter IFNa-behandling.(A) Proteinekspression i Flo-1-celler behandlet med 10 ng/ml IFNa i 2, 6, 24, 48 og 72 timer blev analyseret ved immunoblot under anvendelse af de angivne ISG-antistoffer.(B) Coomassie blå farvede SDS-PAGE geler af helcelleekstrakter efter tværbinding med DSS i angivne tider og koncentrationer.(C) Repræsentativt immunblot undersøgt med p53(DO-1) antistof fra de samme prøver for at vurdere graden af ​​proteintværbinding.
For at fange in situ proteininteraktionslandskabet brugte vi DSS, et meget brugt tværbindingsmiddel på grund af dets høje membranpermeabilitet og relativt korte reaktionstid.Den kortere reaktionstid hjælper med at forhindre dannelsen af ​​store aggregater af tværbundne proteiner, hvorved tværbinderens stabilitet opretholdes.For at bestemme den optimale DSS-koncentration og undgå overtværbinding udsatte vi først cellerne for 5, 2,5 og 1 mM DSS i henholdsvis 5, 10, 5 og 30 minutter og analyserede lysaterne ved Coomassie-farvet SDS-PAGE (data ikke vist).Cellelysater ser ud til at være stærkt tværbundne ved den laveste koncentration og på det korteste tidspunkt.Derfor blev DSS titreret til 1, 0,5 og 0,1 mM over 5 minutter (figur 1B).Optimal tværbinding blev observeret med 0,5 mM DSS i 5 minutter, og disse betingelser blev valgt for celler behandlet med IFNa.Derudover viser figur 1C et Western blot udført under anvendelse af p53 (DO-1) antistoffet til at vurdere graden af ​​proteintværbinding.
Flo-1-celler blev behandlet med 10 ng/ml IFNa i 24 timer før tilsætning af tværbinderen.Tværbundne celler blev efterfølgende lyseret ved to-trins proteolyse, og proteiner blev behandlet af FASP (fig. 2)24,25.Tværbundne tryptiske peptider blev analyseret ved massespektrometri (fig. 2).MS/MS-spektrene matches derefter til proteinsekvensen og kvantificeres med MaxQuant26,27.Tværbundne peptider blev identificeret fra de opnåede spektre ved hjælp af SIM-XL-programmet, og individuelle forbindelser blev kombineret til et komplekst netværk ved hjælp af xQuest28 og SIM-XL29 open source computersoftware pipelines (fig. 2).SIM-XL identificerer protein-protein-interaktioner, interne kæder og individuelle kæder i simple eller komplekse proteinblandinger og giver scripts til at visualisere interaktioner i proteinstrukturer.Derudover rangerer den hver krydsreference som en ID-score i henhold til MS/MS29-spektrumkvaliteten.Adskillige meget pålidelige protein-protein-interaktioner og komplekser er blevet identificeret, og et nyt sæt af interaktioner er blevet yderligere undersøgt ved hjælp af co-immunpræcipitation og konformationelle ændringer af komplekser ved hjælp af molekylær dynamik (MD)-modellering (fig. 2) 30, 31.
Skematisk oversigt over CLMS-metoden.Flo-1-celler blev behandlet med 10 ng/ml IFNa i 24 timer efterfulgt af in situ protein-tværbinding under anvendelse af DSS efterfulgt af cellelyse og trypsinisering.Tværbundne prøver blev analyseret ved hjælp af et Orbitrap massespektrometer og yderligere prøvet for fragmentering af peptidprækursorer under LC-MS/MS.To koblede peptider blev identificeret fra de opnåede spektre ved hjælp af Spectrum Recognition Machine af Crosslinked Peptides (SIM-XL) programmet, og alle forbindelser blev kombineret til et komplekst netværk ved hjælp af beregningsmæssige pipelines.Frafiltrer interaktioner med lav konfidens baseret på falske positive rater (FDR).Adskillige nye high-fidelity protein-protein interaktioner blev yderligere bekræftet ved hjælp af co-immunpræcipitation, og konformationelle ændringer i komplekserne blev undersøgt ved hjælp af molekylær dynamik (MD) modellering.
I alt ~30.500 og ~28.500 peptider blev påvist ved hjælp af MaxQuant i henholdsvis ustimulerede og stimulerede IFNa-prøver (Supplerende tabel S1, Fig. 3A).Peptidlængdefordelingen i begge tilfælde viste en højere andel af større peptider, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​tværbundne peptider (fig. 3B,C).Derudover var en større andel af større peptider til stede i intervallet 40-55 i IFNa-behandlede prøver (fig. 3C).Proteinkortlægning mod log2-intensitet viste, at klassiske interferon-stimulerede proteiner var de mest udbredte sammenlignet med ubehandlede prøver, herunder MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 og HLA-F (figur 3D).Analyse af pathways for proteiner mere end tre gange beriget som svar på IFNa-behandling ved hjælp af Reactome pathway-databasen viste, at MHC-I-medieret antigenpræsentation og -behandling var den mest dominerende vej (figur 3E).I overensstemmelse med tidligere rapporter var antivirale responser medieret af OAS og ISG15 samt IFNa/β og cytokinsignalering blandt de aktiverede veje.Derudover blev lysin- og serin-specifikke protein-tværbindinger identificeret fra de oprindeligt erhvervede MS/MS-spektre ved brug af SIM-XL.En nylig undersøgelse rapporterede 104 ISG'er, der spænder over 20 vira fra 9 virusklasser ved meta-analyse af individuelle ISG-overekspressionsundersøgelser i 5 celletyper9.For at overvinde de beregningsmæssige begrænsninger ved screening af store datasæt startede vi dog med et mindre datasæt for at udforske mulige interaktioner mellem listen over IRDS-gener rapporteret af Padaria et al., hvoraf de fleste er ISG'er.
Identifikation af differentielt udtrykte tværbundne proteiner som respons på IFNa (data opnået fra MaxQuant).(A) Venn-diagram, der repræsenterer antallet af almindelige og eksklusive peptider identificeret i IFNα14-behandlede og ubehandlede Flo-1-prøver.Peptidlængdefordeling af ubehandlede (B) og IFNa-behandlede (C) tværbundne prøver.(D) Varmekort, der repræsenterer log2 (LFQ-intensitet) mellem ubehandlede og IFNa14-behandlede Flo-1-celler.Det venstre panel viser de proteiner, der er mest aktivt aktiveret i nærvær af IFNa.(E) Histogram, der repræsenterer de 20 vigtigste berigelsesveje efter IFNa-behandling.Reactome pathway-databasen analyserede mere end fire gange ændringer i opregulerede IFNa-responsive proteiner.
Interferon-medieret ISG-stimulering er veldokumenteret, men på molekylært niveau er det dårligt forstået, hvordan disse proteiner kulminerer i en lang række biologiske funktioner.Vi undersøgte proteininteraktioner med en høj grad af tillid mellem kendte ISG'er.Interessant nok identificerede vi et netværk inklusive MX1, USP18, ROBO1, OAS3 og STAT1 proteiner, der danner et stort kompleks som svar på IFNa-behandling (figur 4, tabel S2) 32,33,34.Vigtigst er det, at disse interaktioner blev fundet i alle triplikater behandlet med IFNa og blev ikke fundet i ubehandlede prøver, hvilket tyder på, at de blev dannet specifikt som reaktion på IFNa-behandling.Det er kendt, at STAT1 transkriptionelt regulerer ekspressionen af ​​disse ISG'er, men dets interaktion med ISG'er på proteinniveau er ikke blevet undersøgt.Krystalstrukturen af ​​STAT1 viste, at dets spiralformede domæne (CCD) ikke er involveret i interaktionen med DNA eller protomerer under dannelsen af ​​dimerer35.Disse α-helixer danner en spiralformet helixstruktur, der giver et overvejende hydrofilt overfladeareal til interaktioner, der kan forekomme 35 .I vores CLMS-data observerede vi, at de fleste af interaktionerne med STAT1 fandt sted i SH2-domænet forud for CCD, linkerdomænet eller den C-terminale hale (rest 700-708) (figur 4A).En tidligere undersøgelse rapporterede, at USP18 binder til CCD og DNA-bindende domæne (DBD) af STAT2 og rekrutteres til underenheden af ​​type I-interferonreceptoren IFNAR2 for at mediere inhibering af type I-interferonsignalering 24 .Vores data viste også, at det katalytiske USP18-domæne interagerer med STAT1 DBD (figur 4A, D), hvilket tyder på, at både STAT1 og STAT2 kan spille en rolle i at tiltrække USP18 til IFNAR2.
Protein-protein ISG-netværk identificeret i tværbundne celler behandlet med IFNa.(A) 2D-interaktionsplot, der viser protein-protein-interaktioner (genereret i SIM-XL-programmet), med linjer, der repræsenterer intermolekylære interaktioner (crosslink cutoff sat til 3,5).Domæner med forskellige identiteter er markeret med deres farve32: MX1-domæne, Dynamin_N (73-249), Dynamin_M (259-547) og GED (569-660).OAS3-domæner: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) og OAS1_C (903-108).Domæne ROBO1, Ig_3 (67–151), I-sæt (170–258), I-sæt (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) og fn3 (777–864).STAT1-felter: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) og STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Cirkulær seer af tværbundne proteiner (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 og STAT1) med interaktioner og interaktioner mærket i henholdsvis blåt og rødt.Tværbindingstærsklen blev sat til 3,5.Prikplot angiver STAT1-interaktionssteder med MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) og OAS3 (F), såvel som K- eller S-interaktionssteder mellem de to peptider.I figuren er grænseværdien for krydslinkscore sat til 3,0.(G) Forskellige interaktionssteder mellem STAT1 og OAS3 DI domæner overlejret på deres proteinstrukturer i PyMol (PyMOL molecular graphics system, version 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) og OAS3 (pdb id: 4s3n34).) program.
To isoformer af USP18 er blevet beskrevet hos mennesker, et protein i fuld længde, der overvejende er placeret i kernen, og en isoform uden et N-terminalt domæne, USP18-sf, som er jævnt fordelt i cytoplasmaet og kernen 36 .Derudover blev N-terminalen forudsagt at være ustruktureret og kræver ikke isopeptidaseaktivitet eller ISG1537-binding.De fleste af de interaktioner, der blev identificeret i vores undersøgelse, var lokaliseret ved proteinets N-terminale ende, hvilket tyder på, at disse interaktioner involverer USP18 i fuld længde (figur 4A, D) og derfor sandsynligvis forekommer i kernen.Desuden indikerer vores data også, at N-terminalen er specialiseret til protein-til-protein-interaktioner.IFNAR2-bindingsstedet er placeret mellem resterne 312-368, og især binder ingen af ​​proteinerne i komplekset til denne region (fig. 4A) 37,38.Disse data tilsammen indikerer, at IFNAR2-bindingsdomænet udelukkende anvendes af receptorproteinet.Derudover blev kun OAS3 og ROBO1 fundet at være forbundet med domæner opstrøms for N-terminalen og IFNAR2-bindingsstedet (figur 4A).
ROBO1 tilhører immunoglobulin (Ig) superfamilien af ​​transmembrane signalmolekyler og består af fem Ig domæner og tre fibronectin (Fn) domæner i den ekstracellulære region.Disse ekstracellulære domæner efterfølges af en membran-proksimal region og en enkelt transmembran helix 39. En ustruktureret intracellulær region er placeret ved C-terminalen og indeholder konserverede sekvensmotiver, der medierer effektorproteinbinding39.Området, der strækker sig fra aminosyrer ~1100 til 1600, er for det meste uordnet.Vi fandt ud af, at MX1 interagerer med ROBO1 gennem Ig, Fn og intracellulære domæner, mens de fleste interaktioner med STAT1 forekommer mellem dets CCD, linkerdomæne og C-terminalen af ​​ROBO1 (fig. 4A, E).På den anden side var interaktioner med DI-, DIII- og OAS3-linkerregioner fordelt over hele ROBO1-proteinet (fig. 4A).
Oligoadenylatsyntase (OAS) proteinfamilien accepterer og binder intracellulært dobbeltstrenget RNA (dsRNA), gennemgår konformationelle ændringer og syntetiserer 2',5'-bundne oligoadenylater (2-5 As) 40 .Det blev fundet, at blandt de tre OAS'er udviser OAS3 den højeste affinitet for dsRNA og syntetiserer den mindste mængde af 2-5 As, som kan aktivere RNase L og derved begrænse viral replikation 41 .OAS-familien består af polymerase beta (pol-β)-lignende nukleotidtransferasedomæner.Tidligere forskning har vist, at den katalytiske aktivitet af det C-terminale domæne (DIII) er afhængig af det dsRNA-bindende domæne (DI), som er påkrævet for aktiveringen af ​​OAS342.Vi observerede, at DI- og DII-domænerne af OAS3 interagerer med CCD og et lille krydsområde mellem SH2 og STAT1 TAD (figur 4A, F).Overlejring af forskellige tværbindingssteder på proteinstrukturen afslørede en interaktion mellem β-arket og DBD STAT1-løkken og en åben lomme eller hulrum dannet af resterne 60-75 i DI-domænet af OAS3 (fig. 4G).Orienteringen af ​​proteinerne i komplekset indikerede også, at ingen af ​​interaktionerne med OAS3 interfererede med dens DI-domænes DNA-bindingsevne (fig. S1A).Derudover interagerer det N-terminale domæne af GTPase MX1 i vid udstrækning med DI- og DIII-domænerne af OAS3 (fig. 4A).Vi observerede også en interaktion mellem OAS1 og MX1 i alle tre IFNa-behandlede gentagelser, hvor et enkelt OAS1-domæne (også katalytisk aktivt) interagerede med alle tre MX1-domæner (figur S2A, B).
MX-proteiner er en del af en stor familie af dynein-lignende GTPaser, der indeholder et N-terminalt GTPase-domæne, der binder og hydrolyserer GTP, et mellemliggende domæne, der medierer selvsamling, og en C-terminal leucin-lynlås, der fungerer som en GTPase (LZ). ).domæne effektor domæne25,43.MX1 binder til underenheder af virale polymeraser for at blokere transkription af det virale gen43.En tidligere rapporteret gær to-hybrid screening viste, at PIAS1-associeret MX1 hæmmer STAT1-medieret genaktivering ved at blokere DNA-bindingsaktivitet og også har SUMO E344,45 ligaseaktivitet.Her demonstrerer vi, at MX1 binder til STAT1 (figur 4C, D), men hvordan denne interaktion påvirker STAT1-medieret genaktivering som svar på IFNa kræver yderligere undersøgelse.Derudover fandt vi også, at MX1 interagerede med IFIT3 og DDX60 i alle tre IFNa-behandlede gentagelser (fig. S2C).
DDX60 er en IFN-induceret cytoplasmatisk helicase, der tidligere er blevet rapporteret at spille en rolle i RIG-I-uafhængig nedbrydning af viralt RNA46.Det interagerer med RIG-I og aktiverer dets signalering på en ligand-specifik måde 46. DDX60 består af et DEXD/H-Box helicasedomæne og et C-terminalt helicasedomæne, der binder viralt RNA og DNA47.De fleste af dets interaktioner med MX1 og IFIT3 forekommer inden for lange N- og C-terminale områder uden kanoniske domæner eller motiver (fig. S2E, F).MX1 er dog også forbundet med DEXD/H-Box helicase-domænet (fig. S2E).Proteiner fra IFIT-familien har tandemkopier af et karakteristisk helix-turn-helix-motiv kaldet tetrapeptidrepeat (TPR).IFIT3 viste sig at være en positiv modulator af RIG-I-signalering og dermed en komponent i MAVS-komplekset.Samlet tyder vores data på, at IFIT3 og DDX60 interagerer primært i regionen mellem TPR 3-6 af IFIT3 og kan spille en rolle i RIG-I/MAVS-signalering (fig. S2F).
Da screening af hele proteomet er beregningsintensivt, screenede vi derefter hele den humane UniProt-database for tilstedeværelsen af ​​en af ​​de IFNa-behandlede gentagelser.I denne replika fandt vi adskillige meget pålidelige interaktionsnetværk for HLA-A.Analyse af proteinveje identificeret af MS/MS-spektre viste, at MHC-I-baseret antigenbearbejdning og præsentation er hovedvejen induceret af interferon (fig. 3D).Derfor fokuserede vi på at studere proteininteraktionerne af MHC-I-molekyler med en høj grad af tillid i alle tværbundne prøver.HLA består af α1, α2 og α3 domæner og lette kæder, og mikroglobulin β2 (β2m) er et konstant chaperonprotein49.Når først det er samlet i det endoplasmatiske retikulum, er HLA ustabilt i fravær af peptidligander50.Den peptidbindende rille er dannet af de meget polymorfe og ustrukturerede α1- og α2-domæner i ikke-peptidform og det relativt mindre polymorfe α351-domæne.I nærvær af IFNa påviste vi to HLA-A-komplekser: den ene interagerer med HMGA1 og H2B (figur 5, tabel S3), og den anden interagerer med MDN1, LRCH4 og H2B (figur 6).
IFNa inducerer et HLA-A-interaktionsnetværk med H2B (H2BFS) og HMGA1.(A) 2D-plot (genereret i SIM-XL-software), der viser forskellige typer interaktioner i H2B-HLA-A-HMGA1-komplekset: interlink (blå), interlink (rød) og enkelt link (sort)..Domæner med forskellige identiteter er farvekodet32: H2B (histone; 2–102) og MHC-I (MHC_1; 25–203, gruppe C1; 210–290 og MHC_I_C; 337–364).Tværbindingstærsklen blev sat til 3,5.Prikplot angiver HLA-A-interaktionssteder med H2B (B) og HMGA1 (C), såvel som K- eller S-interaktionssteder mellem de to peptider.I figuren er grænseværdien for krydslinkscore sat til 3,0.(D) Relationer mellem proteiner vist i strukturerne af H2B-, HLA-A- og HMGA1-proteinerne i PyMOL-programmet.Disse strukturer blev modelleret ved hjælp af Phyre2-serveren (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), og skabelonstrukturerne for H2B-, HLA-A- og HMGA1-proteinerne var henholdsvis 1kx552, 1kj349 og 2eze55.
IFNa inducerer et HLA-A-interaktionsnetværk med H2B (H2BFS), MDN1 og LRCH4.(A) Intramolekylære (røde) og intermolekylære (blå) tværbindinger præsenteret på et 2D interaktivt kort (genereret i SIM-XL-software) med MDN1 repræsenteret som en cirkel.Tværbindingstærsklen blev sat til 3,5.Domæner med forskellige identiteter er farvekodet32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, gruppe C1; 210–290 og MHC_I_C; 337–364) og LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137-194) og CH (535-641)).(B) Relationer mellem proteiner vist i strukturerne af H2B-, HLA-A-, LRCH4- og MDN1-proteinerne i PyMOL-programmet.Disse strukturer blev modelleret ved hjælp af Phyre2-serveren (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) med skabelonstrukturerne 1kx552, 1kj349, 6hlu62 og 6i2665 for H2B-, HLA-A-, LRCH4- og MDN1-proteinerne, henholdsvis.Prikplot, der viser K- eller S-interaktionssteder for HLA-A med H2B (C), LRCH4 (D) og MDN1 (E).For plots blev tværbindingsscoretærsklen sat til 3,0.
Ud over at opretholde integriteten af ​​genomet er histon H2B også involveret i reguleringen af ​​transkription.H2B-proteinet består af et centralt histondomæne (HFD) dannet af tre α-helixer adskilt af loops og en C-terminal hale 41,52.Det meste af interaktionen med H2B sker i α1-helixen, som giver trimerisering med HFD-heterodimeren (fig. 5A,B).Selvom lysiner er involveret i DNA-binding, er nogle lysiner også alternative acetylerings- eller methyleringssteder.For eksempel er resterne K43, K46 og K57 fra H2B ikke involveret i direkte DNA-binding, men er mål for forskellige post-transkriptionelle modifikationer53.Tilsvarende kan resterne K44, K47 og K57 i H2B spille en alternativ rolle i nærvær af IFNa, herunder interaktioner med andre proteiner (fig. 5A, B).Derudover aktiverer den ekstrakromosomale histon H2B immunresponset i forskellige celletyper, der fungerer som en cytosolisk sensor til at detektere dobbeltstrengede DNA (dsDNA) fragmenter afledt af infektiøse agenser eller beskadigede celler54.I nærvær af DNA-vira hæmmede H2B-depletering IFN-β-produktion og STAT154-phosphorylering.H2B er også kendt for at bevæge sig hurtigere ind og ud af kernen end andre kernehistoner54.H2B-interaktioner med MDN1 og LRCH4 blev også observeret i udvalgte ubehandlede prøver.Vi fandt ud af, at HLA-A interagerede med H2B i alle tre IFNa-behandlede prøver og i en ubehandlet gentagelsesprøve.Disse data afspejler H2B's rolle i en alternativ fysiologisk funktion uafhængig af transkriptionel regulering.
HMGA1 (høj mobilitetsgruppe AT-Hook 1), et lille nukleoprotein rig på sygdomsfremmende aminosyrer, er blevet identificeret i forbindelse med HLA-A.Den har en sur C-terminal hale og tre distinkte DBD'er kaldet AT kroge, fordi de binder til den mindre rille i den AT-rige region i dsDNA55,56.Denne binding får DNA'et til at bøje eller rette sig ud, hvilket giver kanoniske transkriptionsfaktorer adgang til dets konsensussekvens.Den C-terminale hale menes at være involveret i protein-protein-interaktioner og rekruttering af transkriptionsfaktorer, da C-terminale deletionsmutanter ikke er i stand til at starte transkription57.Desuden indeholder dette domæne adskillige konserverede phosphoryleringssteder, der er kendte substrater for kinaser 58 .Vi observerede HLA-A- og H2B-interaktioner med HMGA1 uden for det C-terminale domæne, hvilket tyder på, at det C-terminale domæne hovedsageligt bruges til transkriptionsfaktorbinding (fig. 5A, C).HMGA-proteiner konkurrerer med histon H1 om binding til adapter-DNA og øger derved tilgængeligheden57.På samme måde forekommer det sandsynligt, at HMGA interagerer med histon H2B langs linker-DNA'et i konkurrence med histon H1.HMGB1 inducerer ekspressionen af ​​HLA-A, -B og -C i dendritiske celler, hvilket fører til deres aktivering59, men en interaktion mellem HMG og HLA er ikke tidligere blevet rapporteret.Vi fandt ud af, at HMGA1 interagerer med α1- og α3-domænerne af HLA-A, med de fleste af interaktionerne uden for dets 3 DBD (figur 5A, C).I vores hænder blev HLA-A fundet at være lokaliseret i kernen (data ikke vist), og givet at H2B og HMGA1 også er til stede i kernen, forekommer denne interaktion sandsynligvis i kernen.Specifikke addukter målt mellem H2B, HLA-A og HMGA1 er vist i figur 5D.
De fleste interaktioner af HLA-A med andre proteiner forekommer inden for dets α1- og α2-domæner og det uordnede C-terminale domæne (fig. 6).I et af disse eksempler fandt vi, at HLA-A interagerer med den uordnede N-terminale hale af LRCH4 (figur 6A,D).LRCH4 regulerer TLR4-aktivering og LPS-cytokin-induktion og modulerer derved det medfødte immunrespons60,61.Det er et membranprotein med ni leucinrige gentagelser (LRR'er) og et calmodulin (CH) homologimotiv i dets ektodomæne efterfulgt af et transmembrandomæne (TMD) 60 , 62 .CH-domæner er blevet rapporteret at mediere protein-protein-interaktioner 60 .En strækning på omkring 300 aminosyrer mellem LRR- og CH-domænerne er relativt tilgængelig, men uordnet.Baseret på funktionen af ​​forstyrrede regioner som mediatorer af protein-protein-netværk og vesikulær transport 63 fandt vi, at de fleste proteininteraktioner forekommer i uordnede regioner.Interaktioner med MDN1 blev fordelt over hele proteinets længde, inklusive LRR1, LRR6, CH domænerne og tilfældige regioner, mens H2B hovedsageligt bandt til CH domænet (fig. 6A, B).Navnlig inkluderede ingen af ​​interaktionerne TMJ, hvilket tyder på specificiteten af ​​CLMS-tilgangen (figur 6A, B).
MDN1 er også blevet identificeret som en del af HLA-A-proteinnetværket (figur 6A).Det tilhører AAA-familien af ​​proteiner (ATPaser forbundet med forskellige aktiviteter).Dette er det samme N-terminale AAA-domæne, der organiseres i en hexamer ring og fjerner samlingsfaktoren fra 60S 64 ribosomale underenhed.ser ud til at ligne dynein64,65,66.Derudover efterfølges den Asp/Glu-rige region af MIDAS-domænet (metalionafhængigt sted).På grund af den store størrelse af MDN1 (ca. 5600 aminosyrer) og dens begrænsede homologi med velundersøgte proteiner, er lidt kendt om dets struktur og funktion hos mennesker.Vi identificerede HLA-A, H2B og LRCH4 som MDN1-bindingspartnere og afslørede deres orientering som proteinkomplekser i PyMol (fig. 6A,B).Disse tre proteiner interagerer med AAA-domænet, det dynein-lignende linker-domæne og muligvis MIDAS MDN1-domænet.I en tidligere rapport identificerede affinitetsoprensning af lokkemadproteiner MDN1 som et protein forbundet med histon H2B67.Derudover rapporterede en nylig undersøgelse også en interaktion mellem MDN og HLA-B i HCT116-celler ved hjælp af affinitetsoprenset massespektrometri, hvilket understøtter vores resultater68.Identifikationen af ​​dette kompleks i IFNa-behandlede prøver antyder en rolle for MDN1 i interferon-signalering.
Fordi HLA-gener er meget polymorfe, ekstraherede vi sekventeringslæsninger, der kortlagde HLA-A, -B og -C fra RNA-sekventeringsdata fra Flo-1-celler (data ikke vist).Peptidsekvenser i overensstemmelse med sekventeringsaflæsningen afslørede signifikante forskelle mellem HLA-A, -B og -C i regioner, hvor tværbundne peptider var placeret i HLA-A (figur S3).Derudover observerede vi ikke protein-til-protein-tværbinding af HLA-B/C-molekyler med H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4-proteiner.Dette tyder på, at proteininteraktionen fundet mellem HLA-A, MDN1, LRCH1 og HMGA1 er HLA-A-specifik.Derudover viste proteomisk analyse af ikke-tværbundne prøver (tabel S4), at HLA-A har højere sekvensdækning sammenlignet med HLA-B eller HLA-C.Peptiderne identificeret for HLA-A havde høj intensitet i både IFNa-behandlede og ubehandlede prøver.
For at sikre, at interaktionerne identificeret her ikke skyldtes uspecifik tværbinding af to proteiner i tæt rumlig nærhed, bekræftede vi yderligere to nye HLA-A-interagerende faktorer ved at udføre co-immunpræcipitationsassays.HLA-A-interaktioner med endogen MDN1 og H2B blev påvist i både IFNa-behandlede og ubehandlede Flo-1-celler (figur 7, figur S4).Vi bekræftede, at HLA-A blev fanget af H2B i immunpræcipitaterne, og at denne association skyldtes IFNa-behandling, da HLA-A var fraværende i immunpræcipitatprøverne fra ubehandlede celler (figur 7A).Vores data tyder imidlertid på, at IFNa differentielt regulerer HLA-A-binding til H2B og MDN1.IFNa inducerer association mellem H2B og HLA-A, men reducerer dets association med MDN1.Vi fandt, at MDN1 var forbundet med HLA-A i kontroller, og tilsætningen af ​​IFNa reducerede denne interaktion uafhængigt af MDN1-induktion af IFNa (figur 7B, C).Derudover fangede HLA-A-immunpræcipitation H2B i A549-celler (fig. S4), hvilket tyder på, at denne interaktion er uafhængig af celletype.Tilsammen understøtter disse resultater interferon-medierede interaktioner af HLA-A med H2B og MDN1.
HLA-A co-renser H2B og MDN1.Repræsentative endogene H2B (A) og MDN1 (B) immunoblots blev immunpræcipiteret fra IFNa-behandlede Flo-1 celler og probet for de angivne antistoffer.Mus og kanin IgG blev brugt som en negativ kontrol.(C) Relative mængder (input) af forskellige antigener er afbildet af immunoblots probet mod indikerede antistoffer, β-actin blev brugt som en ladningskontrol.
De strukturelle egenskaber af et af de interferon-inducerede meget pålidelige tværbundne netværk, H2B-HLA-A-HMGA1, blev undersøgt.Vi brugte molekylær dynamikmodellering som en alternativ tilgang til at forstå den konformationelle dynamik af proteinerne involveret i dette kompleks (figur 8).Konklusioner fra CLMS-dataene tyder på muligheden for forskellige konformationer af H2B-, HLA-A- og HMGA1-proteinerne.Derfor blev følgende potentielle komplekser modelleret i et opløsningsmiddelmedium: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A og H2B-HLA-A-HMGA1.En indledende protein-protein docking-skærm under anvendelse af MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) foreslog mulige konformationer, der adskiller sig mellem disse proteiner (fig. 8A).Visualisering af docking-proteinkomplekset afslørede adskillige interaktioner og mulige konformationer (figur 5A, 8).Således er en mulig konformation vist i figur 8A (med mærkede tværbindinger), og den blev yderligere evalueret ved hjælp af MD-modelleringsrørledningen.Derudover fremhæver binding af H2B eller HMGA1 til HLA-A den højere affinitet af H2B til HLA-A (fig. 8A).
Konformationel dynamik af mulige netværk mellem H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A og H2B-HLA-A-HMGA1 komplekserne.(A) Venstre panel er et 2D-kort (genereret i SIM-XL-software) over intramolekylære (røde) og intermolekylære (blå) tværbindinger (tværbindingsgrænse sat til 3,5).Derudover er identificerede tværbindingsrester mærket på strukturerne af H2B-, HLA-A- og HMGA1-proteinerne.De tilknyttede konformationer af disse proteiner blev ekstraheret ved hjælp af docking-pipeline implementeret i MOE-pakken.Det nederste venstre panel viser de forskellige mulige konformationer af H2B-HLA-A- og HMGA1-HLA-A-komplekserne med forskellige protein-proteinbindingsaffiniteter (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standardafvigelse (RMSD) af atomare positioner (eksklusive brintatomer) for hver proteinstruktur.(C) Intermolekylære protein-protein hydrogenbindingsinteraktioner fra forskellige simulerede komplekser under hensyntagen til specifikke interaktioner af varighed ≥ 10 ns.H-bindingen donor-acceptor cutoff-afstand blev sat til 3,5 Å, og donor-H-acceptor cutoff-vinklen blev sat til ≥ 160°-180°.(D) Mærkede rester, der danner HLA-A-protein-protein-interaktioner med deres respektive partnere, der spænder over ≥ 20 ns, ekstraheret fra dummy HLA-A-H2B- og HLA-A-HMGA1-komplekser.Proteinstrukturer repræsenterer en gennemsnitlig struktur på 100 ns MDS.(E) Interaktioner mellem HLA-A-H2B- og HLA-A-HMGA1-komplekser sammenlignet med interaktioner sporet af H2B-HLA-simulering over 100 ns baseret på K- eller S-interaktionsstedet mellem de to peptider.Komplekser /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Tærskelværdien for evaluering af tværbindinger blev sat til 3,0, og specifikke interaktioner fra MDS, der tog ≥ 10 ns, blev taget i betragtning.Proteinstrukturer blev visualiseret ved hjælp af BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) og Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) pakker.
Stabiliteten af ​​HLA-A-molekyler over tid (standardafvigelse; RMSD eller standardafvigelse; RMSF) indikerede, at tilstedeværelsen af ​​H2B- eller HMGA1-proteiner i komplekserne stabiliserede HLA-A (figur 8B, figur S5).HMGA1-proteinet binder tæt til B2M-stedet i HLA-A, hvilket inducerer stabiliteten af ​​HLA-A-aminosyrerne i HLA-A-HMGA1- eller H2B-HLA-A-HMGA1-komplekset (figur 8B, figur S5).især HLA-rester ~60-90 og ~180-210 viste sig at være mindre fleksible i nærvær af H2B (FIG. 8B).H2B og HMGA1 viste bedre binding til HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1-komplekset sammenlignet med HLA-A-binding til H2B eller HMGA1 alene (figur 8C, D; tabel S5).Rester involveret i hydrogenbinding (MD-modelleret høj belægning ≥ 10 ns) falder sammen med CLMS-interaktionssteder (K- eller S-rester) i komplekset, hvilket tyder på, at interaktionerne identificeret af CLMS er meget pålidelige.Pålidelighed (fig. 8E).I CLMS- og MD-modellering blev HLA-A-rester mellem ca. 190-210 og ca. 200-220 aminosyrer fundet at binde henholdsvis H2B og HMGA1 (FIG. 8E).
Protein-protein-interaktioner danner dynamiske strukturelle netværk, der medierer intracellulær kommunikation som reaktion på visse stimuli.Fordi mange proteomiske tilgange detekterer ændringer i det overordnede steady state-niveau af et protein, kræver protein-protein interaktionsdynamik yderligere værktøjer til at fange bindingsgrænseflader, og CLMS er et sådant værktøj.Interferon-signalsystemet er et cytokin-netværk, der tillader celler at reagere på en række miljøpatogene og iboende patologiske signaler, der kulminerer med induktionen af ​​undergrupper af interferon-inducerbare proteiner.Vi anvendte CLMS for at bestemme, om nye protein-protein-interaktioner kunne identificeres blandt et panel af interferon-inducerede proteiner.Global protein-tværbindingsanalyse i en interferon-responsiv Flo-1-cellemodel blev brugt til at fange proteinkomplekser.Ekstraktion af tryptiske peptider fra ikke-tværbundne og tværbundne celler muliggør peptidtælling, pathwayberigelse og peptidlængdefordeling med defineret LFQ-intensitet.Kanoniske interferon-inducerbare proteiner blev identificeret som en positiv intern kontrol, mens nye intermolekylære og intramolekylære tværbundne addukter af kanoniske interferon-inducerbare proteiner såsom MX1, UP18, OAS3 og STAT1 blev observeret.Forskellige strukturelle træk og interaktioner i funktionelle områder er blevet undersøgt.
En interaktion mellem HLA-A, MDN1 og H2B blev påvist ved immunblotting i Flo-1- og A549-celler behandlet og ubehandlet med IFNa.Vores resultater fremhæver, at HLA-A komplekserer med H2B på en IFNa-afhængig måde.Vores arbejde repræsenterer en interessant vej til yderligere udforskning af samlokaliseringen af ​​disse to komplekser.Det ville også være interessant at udvide CLMS-tilgangen til et panel af cellelinjer for at identificere celletype-uafhængige interferon-medierede proteininteraktioner.Endelig brugte vi MD-modellering som en alternativ tilgang til at forstå den konformationelle dynamik af proteiner involveret i H2BFS-HLA-A-HMGA1-komplekset, som sporede intramolekylære og intermolekylære krydstaler.Konklusioner fra CLMS-dataene tyder på muligheden for forskellige konformationer af H2BFS-, HLA-A- og HMGA1-proteinerne.De mulige forskellige konformationer mellem disse docking-proteinkomplekser afslørede adskillige interaktioner svarende til dem, der blev observeret i CLMS-datasættet.En af de vigtigste styrker ved vores metode er, at den tillader nem identifikation af interagerende meget polymorfe gener såsom HLA, så det vil være interessant at studere interaktioner af HLA haplotype-specifikke proteiner, som ellers er svære at studere.Tilsammen viser vores data, at CLMS kan bruges til at udvide vores forståelse af interferon-inducerede signalnetværk og give et grundlag for at studere mere komplekse intercellulære systemer i tumormikromiljøet.
Flo-1-celler blev opnået fra ATCC og holdt i DMEM (Gibco) suppleret med 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% føtalt bovint serum (Gibco) og opbevaret ved 37°C og 5% CO2.Inkubation.Celler blev dyrket til 70-80% konfluens, før de blev behandlet med IFNa14 (fremstillet af Edinburgh Protein Production Facility).Alle andre kemikalier og reagenser blev købt hos Sigma Aldrich, medmindre andet er angivet.
Flo-1-celler blev dyrket i plader med 6 brønde, og den næste dag blev cellerne behandlet med 10 ng/ml IFNa14 i 24 timer til ca. 80 % konfluens.Celler blev vasket tre gange med PBS og ligeret med frisk fremstillet DSS (Thermo Fisher Scientific) (opløst i DMSO) i PBS i 5 minutter ved 37°C til en slutkoncentration på 0,5 mM.DSS-tværbindingsreaktionen blev erstattet med PBS, og resterende DSS blev standset ved tilsætning af 20 mM Tris (pH 8,0) i PBS i 15 minutter ved 37°C.Celler blev opsamlet ved skrabning og opsamlet i lavbindende rør (Axygen).
Cellepelleten blev lyseret med 300 µl urinstoflysebuffer (8 M urinstof, 0,1 M Tris, pH 8,5) i 30 minutter ved stuetemperatur med lejlighedsvis omrystning.Alle centrifugeringstrin blev udført ved 14.000 xg ved 8°C.Centrifuger lysatet i 10 minutter, og overfør supernatanten til et nyt rør.De resterende klare partikler blev opløst i 150 μl af den anden lyseringsbuffer (2 M urinstof, 2 % (vægt/volumen) SDS (natriumdodecylsulfat)) i 30 minutter eller mere, indtil en homogen vandig opløsning blev opnået.Lysatet blev centrifugeret i 20 minutter, og supernatanten blev blandet med lysatet opnået i det foregående trin.Proteinkoncentrationer blev vurderet ved hjælp af Micro BCA-assayet (Thermo Fisher Scientific) i henhold til producentens instruktioner for mikropladeprocedurer.Prøverne blev hurtigt frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80°C.
Cirka 100 μg opløseligt tværbundet protein blev behandlet ved hjælp af en modificeret filtreringsprøveforberedelsesprotokol (FASP) som beskrevet af Wisniewski et al.69 Kort fortalt tværbindes proteinet med 200 µl ureabuffer (8 M urea i 0,1 M Tris, pH 8,5), vortexbehandles og halveres.Alle centrifugeringstrin blev udført ved 14.000 xg ved 25°C.Den første halvdel af det tværbundne proteinlysat blev overført til en 10 kDa Microcon centrifugalfilteranordning udstyret med en Ultracel-10 membran (Merck), efterfulgt af centrifugering på filteret i 25 minutter.Tilføj derefter den anden halvdel af proteinet til filteret og gentag de samme trin.Proteingenvinding blev udført ved at tilsætte 100 μl 17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP) i urinstofbuffer.Udvinding blev omrørt på en termomixer ved 600 rpm i 30 minutter ved 37°C.Desuden blev søjlen centrifugeret, og det reducerede tværbundne protein blev alkyleret under anvendelse af 100 μl 50 mM iodacetamid i urinstofbuffer.Alkyleringsreaktionen blev udført ved stuetemperatur i 20 minutter i mørke.Drej søjlen, vask søjlevæggene 3 gange med 100 µl urinstofbuffer, og centrifuger derefter.Den samme operation blev udført 3 gange med 100 μl 100 mM ammoniumbicarbonat.Før trypsinisering udskiftes opsamlingsrøret med et nyt.Tilsæt fordøjelsesbuffer indeholdende 50 mM ammoniumbicarbonat og 1 µl trypsin fortyndet i trypsinbuffer (Promega).Forholdet mellem trypsin og protein blev holdt på ca. 1:33, og fordøjelsesreaktioner blev inkuberet natten over ved 37°C i et fugtigt kammer.Det tværbundne peptid blev elueret fra filteret ved centrifugering i 25 minutter.Peptidgenvinding blev forbedret ved at tilsætte 50 μl 0,5 M NaCl til filteret efterfulgt af centrifugering i 25 minutter.
C18 Micro Spin-søjler (Harvard Apparatus) blev anvendt til at afsalte tværbundne tryptiske peptider ved at følge protokollen beskrevet af Bouchal et al.70 med mindre modifikationer.Kort fortalt blev C18 spin-søjler aktiveret med tre vaske med 0,1 % myresyre (FA) i acetonitril (AcN) (Merck) og to vaske med 0,1 % FA.Søjlen blev hydreret med 0,1 % FA i 15 minutter.Fyld prøver i centrifugeringskolonner og vask 3 gange med 0,1 % FA.De afsaltede peptider blev sekventielt elueret med en trinvis gradient under anvendelse af 50 %, 80 % og 100 % AcN i 0,1 % FA.Prøverne blev tørret i en SpeedVac Plus-koncentrator (Eppendorf), indtil den resterende væske fuldstændigt forsvandt.De eluerede peptider blev opløst i 100 μl 0,08% trifluoreddikesyre i 2,5% AcN, og koncentrationerne blev målt på en NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Cirka 1 μg tværbundet peptid pr. prøve blev injiceret i LC-MS/MS-systemet.
Tværbundne peptider blev separeret på et UltiMate 3000 RSLCnano LC-system (Thermo Scientific) forbundet til et Orbitrap Exploris 480 massespektrometer (Thermo Scientific).Tværbundne peptider blev opsamlet på en 300 µm ID, 5 mm lang µ-præ-søjle C18 indfangningssøjle pakket med C18 PepMap100 sorbent og 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Indlæs pumpeflowet indstillet til 5 µl/min. 0,08 % trifluoreddikesyre opløst i 2,5 % AcN.Tværbundne peptider blev separeret på en analytisk fusioneret silicasøjle med en indre diameter på 75 μm og en længde på 150 mm, fyldt med en 2 μm PepMap-sorbent (Thermo Scientific).Mobile fase A og B bestod af henholdsvis 0,1 % FA i vand og 0,1 % FA i acetonitril.Gradienten starter ved 2,5 % B og stiger lineært til 40 % B i løbet af 90 minutter, derefter til 90 % B i løbet af de næste 2 minutter.Den mobile fasesammensætning blev holdt ved 90% B i 10 minutter og faldt derefter lineært til 2,5% B i løbet af 2 minutter.Søjlen blev ækvilibreret ved 2,5 % B i 8 minutter før den næste cyklus.Tværbundne peptider elueret fra den analytiske søjle blev ioniseret i en nanoelektrospray-ioniseringskilde (NSI) og injiceret i et Exploris 480 massespektrometer (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 massespektrometeret fungerede i positiv datakorrelationstilstand.En fuld scanning blev udført i sektionstilstand med en opløsning på 120.000 med områdeindstillinger fra m/z 350 Th til m/z 2000 Th.Det normaliserede AGC-mål blev sat til 300% med en maksimal inputtid på 50ms.Monoisotopisk topdetektion er blevet etableret for peptider.Constraint relaxation parameter er sat til sand, hvis der findes for få prækursorer.Den minimale ionstyrke af precursoren blev sat til 5.0e3 og precursor ladningstilstande op til +8 blev inkluderet i eksperimenterne.
Cyklustiden mellem større scanninger i datakorrelationstilstand blev sat til 2,5 sekunder.Dynamisk masseudelukkelse blev sat til 20 s efter den første fragmentering af precursorionen.Precursor-isoleringsvinduet blev sat til 2 Th.Typen af ​​normaliseret kollisionsenergi med en fast kollisionsenergitilstand blev valgt i en dataafhængig MS/MS-scanning.Kollisionsenergi indstillet til 30%.Orbitrap-opløsningen blev sat til 15.000 og AGC-målet til 100 %.Den brugerdefinerede maksimale injektionstid er indstillet til 60 millisekunder.
Før vi sporede protein-protein-netværket i tværbundne prøver, behandlede vi de rå filer ved hjælp af MaxQuant-pakken (version 1.6.12.0)26,27 for at identificere sporbare peptider/proteiner i prøverne.Derudover blev lignende proteomiske analyser udført på ikke-tværbundne Flo-1-prøver behandlet og ubehandlet med IFNa.MS/MS data blev søgt i UniProt human database (www.uniprot.org) (uploadet 12. august 2020, indeholder 75.093 poster) ved hjælp af den indbyggede søgemaskine Andromeda27.Søgningen blev udført uden at angive specificiteten af ​​enzymet og forskellige modifikationer af deamidering (N, Q) og oxidation (M).Precursormassetolerancer blev sat til 20 ppm og produktioner til 0,02 Da.Den indledende og maksimale masseafvigelse blev sat til 10 ppm.Den maksimale masse af peptidet blev sat til 4600 Da, og sekvensligheden blev sat mellem 7 og 25 aminosyrer (aa).Yderligere statistisk analyse blev udført ved hjælp af Perseus-programmet (version 1.6.10.45).Proteinindholdet blev beregnet ved at normalisere den spektrale intensitet af proteinet (LFQ-intensitet; umærket kvantificering)27 og intensitetsværdierne blev konverteret til Log2.En hierarkisk klynge af proteiner identificeret ved deres peptidintensitet blev bygget ved hjælp af pheatmap (v1.0.12) pakken i R (v 4.1.2).Pathway berigelse analyse blev udført ved hjælp af Reactome pathway databasen for IFNa-behandlede proteiner, der var mere end fire gange aktiveret sammenlignet med ubehandlede prøver.
Identifikation af lysin (K) eller serin (S) specifikke kemiske tværbindinger af proteinkomplekser overvåget af LC-MS/MS blev udført ved anvendelse af en spektroskopisk identifikationsmaskine (SIM-XL) for tværbundne peptider (SIM-XL)29.For det første blev mulige interaktioner mellem interferon-associerede (IFN) DNA-skaderesistens-signaturgener (IRDS) gener undersøgt ved hjælp af IRDS-proteindatasættet beskrevet i Padariya et al.28.Screening af alle tilstande og gentagelser af hele den humane UniProt er beregningsintensiv, så hele den humane UniProt-database (www.uniprot.org) (downloadet 12. august 2020, indeholder 75.093 poster) mod IFNα-behandlede gentagelser.Et af filtrene for interaktioner med høj tillid.Disse opnåede interaktioner med høj signifikans blev udvidet og testet under alle gentagelser og betingelser.
I SIM-XL blev DSS brugt til tværbinderen (XL), og XL-vægtforskydningen og modifikationsvægtskiftet blev sat til henholdsvis 138,06 og 156,07.Følgende tværbindingsreaktionssteder tages i betragtning: KK, KS og KN-TERM, uden reporterioner.Både precursor og fragment ppm blev sat til 20, og Xrea-tærsklen blev sat til 0,15.Trypsin blev anset for at være fuldstændig specifikt, og en højenergi C-fælde (HCD) fragmenteringsmetode blev implementeret.XCorr dynamisk DB-reduktionstærskel og minimumsantallet af peptider til dynamisk DB-reduktion blev sat til henholdsvis 2,5 og 2.Andre parametre er: monoisotopsandsynlighed og topkoincidens cutoff, minimum 4 AA-rester pr. streng og maksimal strengladning og 3 maksima for mistede spaltninger.De resulterende sammensyede 2D-kort blev analyseret i (SIM-XL), og den grafiske xQuest28-repræsentation blev brugt til at bygge 2D-kortene.Proteintværbindinger på proteinstrukturer er tilvejebragt i PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC).
Proteinmodelstrukturer blev skabt ved hjælp af Phyre2-serveren (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ved hjælp af principperne for homologimodellering og implementering af "Hidden Markov Method".Phyre2 genererer modelstrukturer baseret på sekvensjustering med kendte proteinstrukturer.Til H2BFS-, HLA-A-, HMGA1-, LRCH4- og MDN1-proteiner blev skabelonstrukturerne 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 og 6i2665 brugt.Derudover blev strukturen af ​​AlphaFold71 MX1, UBP18 og ROBO1 også overvejet.Proteinstrukturen blev visualiseret ved hjælp af BIOVIA Discovery Studio Visualizer-pakken (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) og Molecular Operating Environment-pakken (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).