347 12,7*1,24 mm oprullet rør i rustfrit stål, molekylær mekanisme for synkron elektrostatisk kondensation og koaggregering af α-synuclein og tau

Tak fordi du besøgte Nature.com.Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).For at sikre løbende support viser vi desuden siden uden styles og JavaScript.
Sliders, der viser tre artikler pr. slide.Brug tilbage- og næste-knapperne til at flytte gennem diasene, eller dias-controllerknapperne i slutningen til at flytte gennem hvert dias.

347 Rustfrit stålrør Specifikation

347 12,7*1,24mm Rullerør i rustfrit stål

Udvendig diameter: 6,00 mm OD op til 914,4 mm OD, Størrelser op til 24” NB tilgængelig på lager, OD størrelse Stålrør tilgængelig på lager

SS 347 Rørtykkelsesområde: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S osv. (0,5-12 mm) Eller ikke-normal størrelse, der skal skræddersyes efter behov

Type: SS 347 sømløse rør |SS 347 ERW Rør |SS 347 svejsede rør |SS 347 fremstillede rør |SS 347 CDW-rør, LSAW-rør / søm-svejset / omtegnet

Form: SS 347 runde rør/rør, SS 347 firkantede rør/rør, SS 347 rektangulære rør/rør, SS 347 oprullede rør, SS 347 "U" form, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 hydrauliske rør

Længde: Enkelt tilfældig, dobbelt tilfældig og påkrævet længde ende: almindelig ende, skrå ende, trædeflade

Endebeskyttelse: Plasthætter |Udvendig finish: 2B, nr. 4, nr. 1, nr. 8 spejlfinish til rustfri stålrør, finish i henhold til kundens krav

Leveringstilstand: Udglødet og syltet, poleret, lyst udglødet, koldttrukket

Inspektion, testrapporter: Mølletestcertifikater, EN 10204 3.1, kemiske rapporter, mekaniske rapporter, PMI testrapporter, visuelle inspektionsrapporter, tredjepartsinspektionsrapporter, NABL-godkendte laboratorierapporter, destruktiv testrapport, ikke-destruktive testrapporter

Emballage: Pakket i trækasser, plastikposer, stålstrimler samlet eller efter kunders ønsker

Specials: Andre størrelser og specifikationer end ovenstående kan fremstilles på forespørgsel

SS 347 rørstørrelsesområde: 1/2 tomme NB, OD til 24 tommer

ASTM A312 347: Sømløst og lige søm svejset austenitisk rør beregnet til høje temperaturer og generel korrosiv drift.Spartelmetal er ikke tilladt under svejsning.

ASTM A358 347: Elektrisk smeltesvejst austenitisk rør til korrosiv og/eller højtemperaturservice.Typisk produceres kun rør op til 8 tommer i henhold til denne specifikation.Tilsætning af spartelmetal er tilladt under svejsning.

ASTM A790 347: Sømløst og lige søm svejset ferritisk/austenitisk (dupleks) rør beregnet til generel korrosiv drift, med særlig vægt på modstand mod spændingskorrosionsrevner.

ASTM A409 347: Lige søm eller spiralsøm elektrisk fusionssvejset austenitisk letvægsrør med stor diameter i størrelserne 14" til 30" med vægge Sch5S og Sch 10S til ætsende og/eller høje

ASTM A376 347: Sømløst austenitisk rør til højtemperaturapplikationer.

ASTM A813 347: Enkeltsømmet, enkelt- eller dobbeltsvejset austenitisk rør til høje temperaturer og generelle korrosive anvendelser.

ASTM A814 347: Koldbearbejdet svejset austenitisk rør til høj temperatur og generel korrosiv service.

347H rustfri stålrør kemisk sammensætning

Rustfrit stål 347H rør mekaniske egenskaber

Rustfrit stål 347H rør Fysiske egenskaber

Tilsvarende kvaliteter for 347H rustfrit stålrør

Amyloid alfa-synuclein (αS) aggregering er et kendetegn for Parkinsons sygdom og andre synukleinopatier.For nylig er tau-proteinet, der almindeligvis er forbundet med Alzheimers sygdom, blevet associeret med αS-patologi og fundet at co-lokalisere i αS-rige indeslutninger, selvom den molekylære mekanisme for koaggregering af de to proteiner forbliver uklar.Vi rapporterer her, at αS-fasen adskilles i flydende kondensater via elektrostatisk komplekskondensation med positivt ladede polypeptider såsom tau.Afhængigt af affiniteten af ​​αS for polykationer og hastigheden af ​​valensudtømning af koagulationsnetværket, gennemgår koagler hurtig gelering eller koalescens efterfulgt af langsom amyloid-aggregering.Ved at kombinere en række avancerede biofysiske teknikker var vi i stand til at karakterisere væske-væske αS/Tau-faseseparationen og identificere de nøglefaktorer, der fører til dannelsen af ​​heterogene aggregater indeholdende begge proteiner i et flydende proteinkondensat.
Ud over membranrum kan rumlig adskillelse i celler også opnås ved dannelse af proteinrige, væskelignende tætte legemer kaldet biomolekylære kondensater eller dråber gennem en proces kendt som væske-væskefaseseparation (LLPS).Disse dråber dannes af multivalente tidsmæssige interaktioner, normalt mellem proteiner eller proteiner og RNA, og tjener en række funktioner i næsten alle levende systemer.Et stort antal LLP-kompatible proteiner udviser sekvenser med lav kompleksitet, som er stærkt uordnede i naturen og i dannelsen af ​​biomolekylære kondensater3,4,5.Adskillige eksperimentelle undersøgelser har afsløret den fleksible, ofte uordnede og multivalente natur af de proteiner, der udgør disse væskelignende kondensater, selvom der ikke er meget kendt om de specifikke molekylære determinanter, der styrer væksten og modningen af ​​disse kondensater til en mere fast-lignende stat..
De nye data understøtter hypotesen om, at afvigende protein-drevet LLPS og transformation af dråber til faste strukturer kan være relevante cellulære veje, der fører til dannelsen af ​​uopløselige toksiske aggregater, der ofte er kendetegn ved degenerative sygdomme.Mange LLPS-associerede iboende forstyrrede proteiner (IDP'er), ofte stærkt ladede og fleksible, har længe været forbundet med neurodegeneration gennem processen med amyloid-aggregering.Især biomolekylære IDP-kondensater såsom FUS7 eller TDP-438 eller proteiner med store lavkompleksitetsdomæner såsom hnRNPA19 har vist sig at ældes til gel-lignende eller endda faste former gennem en proces kaldet fluidisering.sammensatte.til fastfaseovergang (LSPT) som funktion af tid eller som reaktion på visse post-translationelle modifikationer eller patologisk signifikante mutationer1,7.
En anden IDP forbundet med LLPS in vivo er Tau, et mikrotubuli-associeret forstyrret protein, hvis amyloidaggregering har været impliceret i Alzheimers sygdom10, men som også for nylig er blevet impliceret i Parkinsons sygdom (PD) og andre synaptiske nukleare proteinopatier 11, 12, 13 er beslægtede.Tau har vist sig spontant at dissociere fra opløsning/cytoplasma på grund af gunstige elektrostatiske interaktioner14, hvilket resulterer i dannelsen af ​​tau-berigede dråber kendt som elektrostatiske koacervater.Det er også blevet observeret, at denne type ikke-specifik interaktion er drivkraften bag mange biomolekylære kondensater i naturen15.I tilfælde af et tau-protein kan elektrostatisk aggregering dannes ved simpel aggregering, hvor modsat ladede områder af proteinet udløser spaltningsprocessen, eller ved kompleks aggregering gennem interaktion med negativt ladede polymerer såsom RNA.
For nylig er α-synuclein (αS), en amyloid IDP impliceret i PD og andre neurodegenerative sygdomme, samlet kendt som synucleinopathy17,18, blevet påvist i cellulære og dyremodeller19,20 koncentreret i proteinkondensater med væskelignende adfærd.In vitro undersøgelser har vist, at αS gennemgår LLPS ved simpel aggregering gennem overvejende hydrofobe interaktioner, selvom denne proces kræver usædvanligt høje proteinkoncentrationer og atypisk lange inkubationstider19,21.Hvorvidt de αS-holdige kondensater observeret in vivo er dannet af denne eller andre LLPS-processer forbliver et centralt uløst problem.Tilsvarende, selvom αS-amyloidaggregering er blevet observeret i neuroner i PD og andre synukleinopatier, forbliver den nøjagtige mekanisme, hvorved αS gennemgår intracellulær amyloidaggregation, uklar, da overekspression af dette protein ikke ser ud til at udløse denne proces i sig selv.Yderligere cellulær skade er ofte påkrævet, hvilket tyder på, at visse cellulære placeringer eller mikromiljøer er påkrævet til gennucleation af intracellulære αS-amyloidsamlinger.Et cellulært miljø, der er særligt udsat for aggregering, kan være det indre af proteinkondensater 23 .
Interessant nok har αS og tau vist sig at co-lokalisere i karakteristiske sygdomsinklusioner hos mennesker med Parkinsons sygdom og andre synukleinopatier 24,25, og eksperimenter har rapporteret en synergistisk patologisk sammenhæng mellem de to proteiner 26,27, hvilket tyder på en potentiel sammenhæng mellem aggregering αS og tau ved neurodegenerative sygdomme.sygdom.αS og tau har vist sig at interagere og fremme hinandens aggregering in vitro og in vivo 28,29, og heterogene aggregater sammensat af disse to proteiner er blevet observeret i hjernen hos patienter med synukleinopatier 30 .Der er dog lidt kendt om det molekylære grundlag for interaktionen mellem αS og tau og mekanismen for dets co-aggregering.αS er blevet rapporteret at interagere med tau gennem en elektrostatisk tiltrækning mellem den stærkt negativt ladede C-terminale region af αS og den centrale prolinrige region af tau, som også er beriget med positivt ladede rester.
I denne undersøgelse viser vi, at αS faktisk kan dissociere til dråber via elektrostatisk kompleks kondensation i nærvær af tau-protein, i modsætning til dets interaktion med andre positivt ladede polypeptider såsom poly-L-lysin (pLK), og i denne proces.αS fungerer som et stilladsmolekyle for dråbenetværket.Vi har identificeret mærkbare forskelle i modningsprocessen af ​​elektrostatiske αS-koacervater, som er forbundet med forskelle i valensen og styrken af ​​interaktionen af ​​proteiner involveret i koacervatnetværket.Interessant nok observerede vi co-aggregering af αS- og tau-amyloidproteiner i langlivede flydende coacervater og identificerede nogle nøglefaktorer, der fører til co-aggregering af disse to proteiner i sådanne coacervater.Her beskriver vi i detaljer denne proces, som er en mulig molekylær mekanisme, der ligger til grund for kolokaliseringen af ​​to proteiner i sygdomsspecifikke indeslutninger.
αS har en meget anionisk C-terminal hale ved neutral pH (fig. 1a), og vi antog, at den kunne gennemgå LLPS gennem kondensation af elektrostatiske komplekser med polykationiske forstyrrede polypeptidmolekyler.Vi brugte en 100-rest poly-L-lysin (pLK) som startmodelmolekyle på grund af dets positivt ladede og uordnede polymere natur ved neutral pH 32. Først bekræftede vi, at pLK interagerer med Ct-domænet af αS via Solution NMR-spektroskopi (Figur 1b) under anvendelse af 13C/15N-mærket αS i nærvær af stigende αS:pLK-molforhold.Interaktionen af ​​pLK med Ct-domænet af αS manifesterer sig i forstyrrelser af det kemiske skift og et fald i topintensiteten i denne region af proteinet.Interessant nok, når vi blandede αS med pLK ved en αS-koncentration på ca.5-25 µM i nærvær af polyethylenglycol (5-15% PEG-8) (typisk LLPS-buffer: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) gik vi straks gennem et bredt felt af proteindannelse .dråber blev observeret under anvendelse af fluorescens (WF) og lysfelts (BF) mikroskopi (fig. 1c).1-5 µm dråber indeholdende koncentreret αS (tilsat 1 µM AlexaFluor488-mærket αS, AF488-αS), deres elektrostatiske egenskaber kan udledes af deres modstand mod 10 % 1,6-hexandiol (1,6-HD) og dets følsomhed overfor en stigning i NaCl-koncentrationen (fig. 1c).Den væskelignende natur af coacervaterne af det αS/pLK elektrostatiske kompleks demonstreres ved deres evne til at smelte sammen inden for millisekunder (fig. 1d).Ved hjælp af turbidimetri kvantificerede vi dannelsen af ​​dråber under disse betingelser, bekræftede den elektrostatiske karakter af hovedinteraktionen forbundet med dens stabilitet (fig. 1e) og evaluerede effekten af ​​forskellige polymerforhold på LLPS-processen (fig. 1f).Selvom dråbedannelse observeres over et bredt område af polymerforhold, er processen meget gunstig, når pLK er over αS.LLP'er er også blevet observeret ved anvendelse af det kemisk forskellige fortrængningsmiddel dextran-70 (70 kDa) eller ved anvendelse af en række prøveformater, herunder glasglasdråber, mikropladebrønde af forskellige materialer, Eppendorf- eller kvartskapillærer.
en skematisk repræsentation af forskellige proteinregioner i WT-αS- og ΔCt-αS-varianterne anvendt i denne undersøgelse.Det amfipatiske N-terminale domæne, det hydrofobe amyloiddannende (NAC) område og det negativt ladede C-terminale domæne er vist i henholdsvis blåt, orange og rødt.Netto Charge Per Residual (NCPR)-kortet over WT-αS er vist.b NMR-analyse af αS/pLK-interaktionen i fravær af makromolekylære klumper.Når pLK-koncentrationen stiger (aS:pLK-molforhold på 1:0,5, 1:1,5 og 1:10 vises i henholdsvis lysegrøn, grøn og mørkegrøn).c Coacervat αS/pLK (molært forhold 1:10) ved 25 µM (1 µM AF488-mærket αS eller Atto647N-mærket pLK til WF-billeddannelse) i LLPS-buffer (øverst) eller suppleret med 500 mM NaCl (nederst til venstre) eller efter 10 % 1,6-hexandiol (1,6-HD; nederst til højre).Målestok = 20 µm.d Repræsentative mikroskopiske billeder af BF-dråbefusion af αS/pLK (molforhold 1:10) ved en koncentration på 25 μM;pile angiver sammensmeltningen af ​​individuelle dråber (røde og gule pile) til en ny dråbe (orange pil) inden for 200 ms).Målestok = 20 µm.e Lysspredning (ved 350 nm) αS/pLK-aggregering i LLPS-buffer før og efter tilsætning af 500 mM NaCl eller 10 % 1,6-HD ved 25 µM αS (N = 3 prøvegentagelser, middelværdi og standardafvigelse er også angivet).f BF-billede (øverst) og lysspredningsanalyse (ved 350 nm, bund) af αS/pLK-aggregering ved 25 μM αS med stigende αS:pLK-molforhold (N = 3 prøvegentagelser, middelværdi og standardafvigelse er også angivet).Målestok = 10 µm.Skaleringslinjen på ét billede angiver skalaen af ​​alle billeder i ét panel.Rådata leveres i form af rådatafiler.
Baseret på vores observationer af αS/pLK elektrostatisk komplekskondensation og tidligere observationer af αS som et klientmolekyle af tau/RNA-kondensatet gennem direkte interaktion med tau31, antog vi, at αS og tau kunne co-segregere med opløsningsmidlet i fravær af RNA kondensation.gennem elektrostatiske komplekser, og αS er stilladsproteinet i αS/Tau-koacervater (se tau-ladningsfordeling i figur 2e).Vi observerede, at når 10 μM αS og 10 μM Tau441 (indeholdende henholdsvis 1 μM AF488-αS og 1 μM Atto647N-Tau) blev blandet sammen i LLPS-buffer, dannede de let proteinaggregater indeholdende begge proteiner, som det ses af WF-mikroskopi.(Fig. 2a).Kolokaliseringen af ​​de to proteiner i dråberne blev bekræftet ved konfokal (CF) mikroskopi (Supplerende Fig. 1a).Lignende adfærd blev observeret, når dextran-70 blev anvendt som et aggregeringsmiddel (Supplerende Fig. 1c).Ved at bruge enten FITC-mærket PEG eller dextran fandt vi ud af, at begge crowding-midler var jævnt fordelt på tværs af prøverne, hvilket hverken viste adskillelse eller association (Supplerende Fig. 1d).Det tyder snarere på, at de i dette system fremmer faseadskillelse gennem makromolekylære crowding-effekter, da PEG er et fortrinsvis stabilt crowding-middel, som det ses i andre LLP-systemer33,34.Disse proteinrige dråber var følsomme over for NaCl (1 M), men ikke over for 1,6-HD (10 % v/v), hvilket bekræfter deres elektrostatiske egenskaber (Supplerende Fig. 2a, b).Deres væskeadfærd blev bekræftet ved at observere millisekunders fusionerende dråbehændelser under anvendelse af BF-mikroskopi (fig. 2b).
et konfokale (CF) mikroskopibilleder af αS/Tau441-koacervater i LLPS-buffer (10 μM af hvert protein, 0,5 μM AF488-mærket αS og Atto647N-mærket Tau441).b Repræsentative DIC-billeder (Differential Interference Contrast) af αS/Tau441-dråbefusionshændelser (10 μM for hvert protein).c Fasediagram baseret på lysspredning (ved 350 nm) af Tau441 LLPS (0-15 µM) i fravær (venstre) eller tilstedeværelse (højre) af 50 µM αS.Varmere farver indikerer mere spredning.d Lysspredning af αS/Tau441 LLPS-prøver med stigende αS-koncentration (Tau441 ved 5 µM, N = 2-3 prøvegentagelser som angivet).e Skematisk repræsentation af nogle tau-proteinvarianter og forskellige regioner af proteinet anvendt i denne undersøgelse: negativt ladet N-terminalt domæne (rødt), prolinrigt område (blåt), mikrotubuli-bindende domæne (MTBD, fremhævet med orange) og amyloiddannende parspiral.filamentregioner (PHF) placeret inden for MTBD (grå).Netto Charge Per Residue (NCPR)-kortet over Tau441 er vist.f Anvendelse af 1 µM AF488-mærket αS og Atto647N-mærket ΔNt-, ved anvendelse af 1 µM AF488-mærket αS eller ΔCt-αS i nærværelse af ΔNt-Tau (øverst, 10 µM pr. protein) eller K150-protein (bund) ) ) ) mikrofotografier af WF kondenseret i LLPS eller K18 buffer.Målestoksøjlerne i ét billede repræsenterer skalaen af ​​alle billeder i ét panel (20 µm for panelerne a, b og f).Rådata for panel c og d leveres som rådatafiler.
For at teste αS's rolle i denne LLPS-proces undersøgte vi først virkningen af ​​αS på dråbestabiliteten ved nefelometri ved hjælp af stigende koncentrationer af NaCl (fig. 2c).Jo højere saltkoncentrationen er i prøverne, der indeholder αS, jo højere er lysspredningsværdierne (ved 350 nm), hvilket indikerer den stabiliserende rolle af αS i dette LLPS-system.En lignende effekt kan observeres ved at øge αS-koncentrationen (og dermed αS:Tau441-forholdet) til ca.10-fold stigning i forhold til tau-koncentrationen (5 µM) (fig. 2d).For at demonstrere, at αS er et stilladsprotein i coacervater, besluttede vi at undersøge adfærden af ​​den LLPS-forstyrrede Tau-mutant, som mangler en negativt ladet N-terminal region (rest 1-150, se fig. 2e) kaldet ΔNt-Tau.WF-mikroskopi og nefelometri bekræftede, at ΔNt-Tau selv ikke undergik LLPS (Fig. 2f og Supplerende Fig. 2d), som tidligere rapporteret 14. Men når αS blev tilsat til dispersionsopløsninger af denne trunkerede Tau-variant, var LLPS-processen fuldstændig gendannet med dråbedensitet tæt på dråbetætheden af ​​opløsninger i fuld størrelse af Tau og αS under lignende betingelser og proteinkoncentrationer.Denne proces kan også observeres under forhold med lav makromolekylær trængsel (Supplerende Fig. 2c).Rollen af ​​den C-terminale αS-region, men ikke hele dens længde, i LLPS-processen blev demonstreret ved hæmning af dråbedannelse ved anvendelse af en C-terminal trunkeret αS-variant, der mangler resterne 104-140 (fig. 1a) af (ΔCt- aS) protein (fig. 2f og supplerende fig. 2d).Kolokaliseringen af ​​αS og ΔNt-Tau blev bekræftet ved konfokal fluorescensmikroskopi (Supplerende Fig. 1b).
For yderligere at teste LLPS-mekanismen mellem Tau441 og αS blev der brugt en yderligere Tau-variant, nemlig det parrede helical filament core (PHF) fragment i det mikrotubuli-bindende domæne (MTBD), som, hvis det indeholder fire karakteristiske gentagelsesdomæner, almindeligvis også kendt som K18-fragmentet (se fig. 2e).Det er for nylig blevet rapporteret, at αS fortrinsvis binder til et tau-protein lokaliseret i et prolinrigt domæne i en sekvens, der går forud for det mikrotubuli-bindende domæne.Imidlertid er PHF-regionen også rig på positivt ladede rester (se figur 2e), især lysin (15 % rester), hvilket fik os til at teste, om denne region også bidrager til kondenseringen af ​​αS/Tau-komplekset.Vi observerede, at K18 alene ikke kunne udløse LLPS ved koncentrationer op til 100 μM under de testede betingelser (LLPS-buffer med 15% PEG eller 20% dextran) (figur 2f).Men når vi tilføjede 50 µM αS til 50 µM K18, blev hurtig dannelse af proteindråber indeholdende K18 og αS observeret ved nefelometri (Supplerende Fig. 2d) og WF-mikroskopi (Fig. 2f).Som forventet var ΔCt-αS ude af stand til at genoprette LLPS-adfærden af ​​K18 (fig. 2f).Vi bemærker, at αS/K18-aggregering kræver lidt højere proteinkoncentrationer for at inducere LLPS sammenlignet med αS/ΔNt-Tau eller αS/Tau441, alt andet lige.Dette er i overensstemmelse med en stærkere interaktion af den αS C-terminale region med det prolinrige Tau-domæne sammenlignet med det mikrotubuli-bindende domæne, som beskrevet tidligere 31 .
I betragtning af at ΔNt-Tau ikke kan udføre LLPS i fravær af αS, valgte vi denne Tau-variant som en model til at karakterisere αS/Tau LLPS givet dens enkelhed i LLPS-systemer med fuldlængde Tau (isotype, Tau441/Tau441).med komplekse (heterotypiske, αS/Tau441) aggregeringsprocesser.Vi sammenlignede graden af ​​αS-aggregering (som en del af det kondenserede faseprotein, fαS,c) i αS/Tau- og αS/ΔNt-Tau-systemerne ved centrifugering og dispergeret fase SDS-PAGE-analyse (se 2e), fandt meget lignende værdier for alle proteiner i samme koncentration.Især opnåede vi fαS,c 84 ± 2% og 79 ± 7% for henholdsvis αS/Tau og αS/ΔNt-Tau, hvilket tyder på, at den heterotypiske interaktion mellem αS og tau er overlegen i forhold til interaktionen mellem tau-molekyler.mellem.
Interaktionen med forskellige polykationer og virkningen af ​​kondensationsprocessen på αS-kinetikken blev først undersøgt ved fluorescensgenvinding efter fotoblegning (FRAP) metoden.Vi testede αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau og αS/pLK coacervater (100 μM αS suppleret med 2 μM αS AF488-αS og 100 μM Tau441 eller ΔNt-Tau eller 1 mM pLK).Data blev opnået inden for de første 30 minutter efter blanding af prøvekomponenterne.Fra repræsentative FRAP-billeder (fig. 3a, αS/Tau441-kondensation) og deres tilsvarende tidsforløbskurver (fig. 3b, supplerende fig. 3), kan det ses, at αS-kinetikken er meget lig dem for Tau441-koacervater.og ΔNt-Tau, som er meget hurtigere med pLK.De beregnede diffusionskoefficienter for αS inde i koacervatet i overensstemmelse med FRAP (som beskrevet af Kang et al. 35) er D = 0,013 ± 0,009 µm2/s og D = 0,026 ± 0,008 µm2/s for αS/TauS/ΔN αS/Tau441 og αS/-systemet.pLK, Tau og D = henholdsvis 0,18 ± 0,04 µm2/s (fig. 3c).Imidlertid er diffusionskoefficienten αS i den dispergerede fase adskillige størrelsesordener højere end alle kondenserede faser, som bestemt ved fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS, se Supplerende Fig. 3) under de samme betingelser (LLPS buffer), men i fravær af polykationer (D = 8 ± 4 µm2/s).Derfor er kinetikken af ​​αS-translation signifikant reduceret i coacervater sammenlignet med proteiner i den dispergerede fase på grund af udtalte molekylære crowding-effekter, selvom alle coacervater bevarer væskelignende egenskaber i løbet af den første halve time efter deres dannelse, i modsætning til tau-fasen.hurtigere kinetik i pLK-kondensat.
a–c FRAP-analyse af αS-dynamik (2% AF488-mærket αS) i elektrostatiske koacervater.Repræsentative billeder af αS/Tau441 FRAP-assays i tre eksemplarer er vist i (a), hvor røde cirkler indikerer affarvede områder.Skalaen er 5 µm.b Gennemsnitlige FRAP-kurver og (c) beregnede diffusionskoefficienter (D) for 5-6 (N) forskellige dråber fra tre eksperimenter med 100 µM αS og ækvimolære koncentrationer af Tau441 (rød) eller ΔNt-Tau (blå) eller pLK (grøn) ved ti gange koncentrationen af ​​LLPS.Standardafvigelsen for FRAP-kurven er vist i skraveret farve.Til sammenligning blev diffusionskoefficienten αS i den dispergerede fase bestemt i tre eksemplarer ved anvendelse af fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) (se supplerende figur 3 og metoder for mere information).d Kontinuerlige X-bånds EPR-spektre på 100 μM TEMPOL-122-αS i LLPS-buffer uden nogen polykation (sort) eller i nærværelse af 100 μM Tau441 (rød) eller ΔNt-Tau (blå) eller 1 mM pLK (grøn).Indsatsen viser et forstørret billede af de stærke feltlinjer, hvor de mest dramatiske ændringer sker.e Bindingskurver på 50 μM TEMPOL-122-αS med forskellige polykationer i fravær af LLPS (ingen PEG).Den reducerede amplitude af bånd III sammenlignet med bånd II (IIII/III) af det normaliserede EPR-spektrum er vist at øge molforholdet mellem Tau441 (rød), ΔNt-Tau (blå) og pLK (grøn).Farvede linjer viser tilpasning til data ved hjælp af en grov bindingsmodel med n identiske og uafhængige bindingssteder på hver kurve.Rådata leveres i form af rådatafiler.
Som et supplement undersøgte vi dynamikken af ​​αS i forskellige coacervater ved hjælp af rettet spin-mærkning (SDSL) og kontinuerlig elektron paramagnetisk resonans (CW-EPR).Denne metode har vist sig at være meget nyttig til at rapportere fleksibiliteten og dynamikken i IDP med en realistisk resterende opløsning36,37,38.Til dette formål konstruerede vi cysteinrester i enkelte Cys-mutanter og brugte 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-N-oxyl (TEMPOL) spinproben.Maleimidderivater mærker dem.Mere specifikt indsatte vi TEMPOL-prober i position 122 eller 24 αS (TEMPOL-122-αS og TEMPOL-24-αS).I det første tilfælde målretter vi den C-terminale region af proteinet, som er involveret i interaktion med polykationer.I stedet kan position 24 give os information om den overordnede dynamik af proteinerne i kondensatet.I begge tilfælde svarede EPR-signalerne opnået for proteiner i den dispergerede fase til nitroxidradikaler i den hurtigt bevægende tilstand.Efter faseadskillelse i nærvær af tau eller pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 eller ΔNt-Tau i et forhold på 1:1 eller pLK i et forhold på 1:10), blev der observeret en stigning i den relative topintensitet i EPR-spektret af αS.Tabslinjen blev udvidet, hvilket indikerer reduceret αS-reorienteringskinetik i dråber sammenlignet med protein i fortyndet fase (fig. 3d, supplerende fig. 4a).Disse ændringer er mere udtalte i position 122. Mens tilstedeværelsen af ​​pLK i position 24 ikke påvirkede probens kinetik, ændrede den spektrale linjeform sig signifikant i position 122 (supplerende fig. 4a).Da vi forsøgte at modellere spektrene ved position 122 af to αS/polykationsystemer ved hjælp af den isotrope model (Supplerende figur 5a), der almindeligvis bruges til at beskrive dynamikken i spin-mærket IDP38,39, var vi ikke i stand til at rekonstruere de eksperimentelle spektre..Spektral simulering af positionen af ​​24 spins kontraster (Supplerende Fig. 5a).Dette tyder på, at der er præferencepositioner i rummet af spin-konfigurationer af den C-terminale region af αS i nærvær af polykationer.Når man overvejer fraktionen af ​​αS i den kondenserede fase under eksperimentelle EPR-betingelser (84 ± 2 %, 79 ± 7 % og 47 ± 4 % for henholdsvis αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau og αS/pLK – se Supplerende Fig. 2e af dataanalyse c), kan det ses, at udvidelsen detekteret med EPR-metoden hovedsageligt afspejler interaktionen af ​​den C-terminale region af αS med forskellige polykationer i den kondenserede fase (hovedændringen ved brug af TEMPOL-122- αS), og ikke proteinkondensation.En stigning i mikroviskositet observeres i proben.Som forventet blev EPR-spektret af proteinet under andre betingelser end LLPS fuldstændigt genoprettet, når 1 M NaCl blev tilsat til blandingen (Supplerende Fig. 4b).Samlet set tyder vores data på, at ændringerne detekteret af CW-EPR hovedsageligt afspejler interaktionen af ​​den C-terminale region af αS med forskellige polykationer i den kondenserede fase, og denne interaktion ser ud til at være stærkere med pLK end med Tau.
For at opnå mere strukturel information om proteinerne i coacervatet besluttede vi at studere LLPS-systemet ved hjælp af NMR i opløsning.Vi kunne dog kun detektere den αS-fraktion, der var tilbage i den dispergerede fase, hvilket kan skyldes reduceret proteindynamik inde i coacervatet og en tæt fase i bunden af ​​opløsningen i NMR-analyse.Da vi analyserede strukturen og dynamikken af ​​det protein, der var tilbage i den dispergerede fase af LLPS-prøven ved hjælp af NMR (Supplerende Fig. 5c, d), bemærkede vi, at proteinet opførte sig næsten identisk i nærværelse af pLK og ΔNt-Tau, begge af som var i proteinrygradens sekundære struktur og dynamik, afsløret ved eksperimenter med sekundært kemisk skift og R1ρ-relaksation.NMR-data viser, at C-terminalen af ​​aS lider af et betydeligt tab af konformationel fleksibilitet, mens den bibeholder sin uordnede natur, ligesom resten af ​​proteinsekvensen, på grund af dens interaktioner med polykationer.
Da CW-EPR-signaludvidelsen observeret i den kondenserede TEMPOL-122-αS-fase afspejler interaktionen af ​​proteinet med polykationer, udførte vi en EPR-titrering for at evaluere bindingsaffiniteten af ​​αS til forskellige polykationer i fravær af LLPS (ingen akkumulering af Buffer LLPS), hvilket tyder på, at interaktionerne er de samme i fortyndede og koncentrerede faser (hvilket bekræftes af vores data, Supplerende Fig. 4a og Supplerende Fig. 6).Målet var at se, om alle coacervater, på trods af deres fælles væskelignende egenskaber, udviser nogen underliggende differentiel adfærd på molekylært niveau.Som forventet blev EPR-spektret udvidet med stigende polykationkoncentration, hvilket afspejler et fald i molekylær fleksibilitet på grund af molekylære interaktioner mellem alle interaktionspartnere næsten til mætning (Fig. 3e, Supplerende Fig. 6).pLK opnåede denne mætning ved et lavere molforhold (polykation:αS) sammenlignet med ΔNt-Tau og Tau441.Faktisk viste sammenligning af dataene med en omtrentlig bindingsmodel, der antager n identiske og uafhængige bindingssteder, at den tilsyneladende dissociationskonstant for pLK (~5 μM) er en størrelsesorden lavere end den for Tau441 eller ΔNt-Tau (~50 μM) ).µM).Selvom dette er et groft skøn, tyder dette på, at αS har en højere affinitet for enklere polykationer med kontinuerte positive ladningsområder.I betragtning af denne forskel i affinitet mellem αS og forskellige polykationer, antog vi, at deres flydende egenskaber kan ændre sig forskelligt over tid og dermed lide af forskellige LSPT-processer.
I betragtning af det meget overfyldte miljø i proteinkoacervatet og proteinets amyloide natur observerede vi coacervatets adfærd over tid for at detektere mulige LSPT-processer.Ved hjælp af BF- og CF-mikroskopi (Figur 4) observerede vi, at αS/Tau441 koacerverer i vid udstrækning i opløsning og danner store dråber, der kommer i kontakt med og fugter overfladen i bunden af ​​brønden/glasset som fulde dråber, som forventet (Supplerende Fig. 7d);vi kalder disse bundformede strukturer for "proteinflåder".Disse strukturer forblev flydende, da de bibeholdt evnen til at smelte sammen (Supplerende Fig. 7b) og kunne ses i flere timer efter LLPS blev udløst (Fig. 4 og Supplerende Fig. 7c).Vi observerede, at befugtningsprocessen foretrækkes på overfladen af ​​hydrofile frem for hydrofobe materialer (Supplerende Fig. 7a), som forventet for elektrostatiske coacervater med ubalancerede ladninger og dermed høje elektrostatiske overfladepotentialer.Navnlig blev αS/ΔNt-Tau-sammensmeltning og rafting signifikant reduceret, mens αS/pLK-kondensat blev signifikant reduceret (fig. 4).I løbet af den korte inkubationstid var αS/pLK-dråberne i stand til at smelte sammen og fugte den hydrofile overflade, men denne proces stoppede hurtigt, og efter 5 timers inkubation blev der kun observeret begrænsede koalescenshændelser og ingen befugtning.– gel-dryp overgang.
Repræsentative BF (gråskalapaneler) og CF (højre paneler, AF488-mærket αS i grønt) af koacervatprøver indeholdende 100 µM αS (1 % fluorescerende mærke) i LLPS-buffer i nærværelse af 100 µM Tau441 (øverst) fluorescensbilleder ΔN -Tau (i midten) eller 1 mM pLK (bund) ved forskellige inkubationstider og brændvidder (z, afstand fra bunden af ​​pladebrønden).Forsøgene blev gentaget 4-6 gange uafhængigt af hinanden med samme resultater.αS/Tau441-koacervater fugtes efter 24 timer og danner flåder, der er større end billedet.Skalalinjen for alle billeder er 20 µm.
Vi spurgte derefter, om de store væskelignende proteinpuljer dannet i αS/Tau441 LLPS ville føre til amyloid-aggregering af nogen af ​​de undersøgte proteiner.Vi fulgte modningen af ​​αS/Tau441-dråber over tid med WF-mikroskopi under de samme betingelser som ovenfor, men ved hjælp af 1 μM AF488-mærket αS og Atto647N-mærket Tau441 (fig. 5a).Som forventet observerede vi fuldstændig proteinlokalisering gennem hele modningsprocessen.Interessant nok fra ca.Efter 5 timer blev der observeret mere intense ikke-cirkulære strukturer inde i flåderne, som vi kaldte "punkter", hvoraf nogle var kolokaliseret med αS, og nogle var beriget med Tau441 (Fig. 5a, hvide pile).Disse pletter er altid blevet observeret inden for flåder i højere grad for αS/ΔNt-Tau end for αS/ΔNt-Tau.Der var ingen tydelige pletter i dråberne af pLK- og Tau-systemer, der var inkompetente til fusion/befugtning.For at teste om disse pletter indeholdende αS og Tau441 er amyloid-lignende aggregater, udførte vi et lignende eksperiment ved hjælp af CF-mikroskopi, hvor Tau441 blev mærket med Atto647N og 12,5 μM amyloid-specifik thioflavin-T (ThT) blev tilføjet fra starten.farvestof.Selvom ThT-farvning af αS/Tau441-dråber eller -flåder ikke blev observeret selv efter 24 timers inkubation (fig. 5b, øverste række - resterende dråber over proteinflåder), var ThT-positive strukturer indeholdende Atto647N-Tau441 inde i flåderne meget svage.dette replikerer størrelsen, formen og placeringen af ​​de tidligere beskrevne pletter (fig. 5b, midterste og nederste rækker), hvilket tyder på, at pletterne kan svare til amyloidlignende aggregater dannet i aldrende væskekoacervater.
WF 25 μM αS ved forskellige inkubationstider og brændvidder (z, afstand fra ubundet bund) i nærværelse af 25 μM Tau441 (1 μM AF488-mærket αS og Atto647N-mærket Tau441) i en brønd på en mikroskopplade med LLPS-buffer) .Seks eksperimenter blev gentaget uafhængigt med lignende resultater.b CF mikroskopisk billede af 25 μM αS i nærværelse af 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-mærket Tau441) og 12,5 μM thioflavin-T (ThT).Vægtede proteindråber og aflejrede proteinflåder og pletter er vist i henholdsvis øverste og midterste række.Den nederste række viser billeder af flåder og fald fra 3 uafhængige replikater.Hvide pile angiver ThT-positive prikker i begge paneler.Skalalinjen for alle billeder er 20 µm.
For mere detaljeret at undersøge ændringerne i koacervatproteinnetværket under overgangen fra væske til fast stof, brugte vi fluorescenslivstidsbilleddannelse (FLIM) og Förster resonansenergioverførselsmikroskopi (FRET) (figur 6 og supplerende figurer 8 og 9).Vi antog, at den koacervate modning af laget til en mere kondenseret eller endda fast-lignende aggregeret proteinstruktur fører til tættere kontakt mellem proteinet og den fluorescerende probe, der er knyttet til det, hvilket potentielt producerer en quenching-effekt manifesteret i en forkortet probelevetid (τ) , som tidligere beskrevet40.,41,42.For dobbeltmærkede prøver (AF488 og Atto647N som henholdsvis FRET-donor- og acceptorfarvestoffer) kan dette fald i τ desuden også ledsages af koacervatkondensation og en stigning i FRET(E)-effektivitet under LSPT.Vi overvågede flåde- og pletdannelse over tid i LLPS αS/Tau441 og αS/ΔNt-Tau prøver (25 µM af hvert protein i LLPS buffer indeholdende 1 µM AF488 mærket αS og/eller Atto647N mærket Tau441 eller ΔNt-Tau).Vi observerede en generel tendens i, at fluorescenslevetiden for AF488 (τ488) og Atto647N (τ647N) proberne faldt lidt, efterhånden som coacervaterne modnes (fig. 6 og supplerende fig. 8c).Interessant nok blev denne ændring signifikant forstærket for prikker i flåder (fig. 6c), hvilket indikerer, at yderligere proteinkondensering fandt sted ved prikker.Til støtte for dette blev der ikke observeret nogen signifikant ændring i fluorescenslevetid for αS/ΔNt-Tau-dråber, der var ældet i 24 timer (Supplerende Fig. 8d), hvilket tyder på, at dråbegelering er en proces, der adskiller sig fra pletblødning, og som ikke er ledsaget af væsentlig molekylær reorganisering inden for koacervater.Det skal bemærkes, at prikkerne har forskellige størrelser og variabelt indhold i αS, især for αS/Tau441-systemet (Supplerende Fig. 8e).Faldet i pletfluorescenslevetid blev ledsaget af en stigning i intensitet, især for Atto647N mærket Tau441 (Supplerende Fig. 8a), og højere FRET-effektiviteter for både αS/Tau441 og αS/ΔNt-Tau-systemer, hvilket indikerer yderligere kondensation i LLPS Fem timer efter udløsning kondenserede proteinerne inde i den statiske elektricitet.Sammenlignet med αS/ΔNt-Tau observerede vi lavere τ647N og noget højere τ488-værdier i αS/Tau441-pletter, ledsaget af lavere og mere inhomogene FRET-værdier.Dette kan muligvis hænge sammen med, at i αS/Tau441-systemet er den observerede og forventede αS-overflod i aggregater mere heterogen, ofte substøkiometrisk sammenlignet med Tau, da Tau441 selv også kan gennemgå LLPS og aggregering (Supplerende Fig. 8e) .Imidlertid er graden af ​​dråbesammensmeltning, tømmerflådedannelse og, hvad der er vigtigt, proteinaggregering i væskelignende koacervater maksimal, når både Tau441 og αS er til stede.
a Lifetime fluorescensmikroskopi (FLIM) billeder af αS/Tau441 og αS/ΔNt-Tau ved 25 μM af hvert protein (1 μM AF488-mærket αS og 1 μM Atto647N-mærket Tau441 eller ΔNt-PSTau) buffer.Søjlerne viser repræsentative billeder af LLPS-prøver ved forskellige modningstider (30 min, 5 timer og 24 timer).Den røde ramme viser området, der indeholder αS/Tau441-pletter.Levetiden er vist som farvebjælker.Målestok = 20 µm for alle billeder.b Zoomet ind FLIM-billede af det valgte område, vist i det røde felt i panel a.Livsintervaller er vist med samme farveskala som i panel a.Målestok = 5 µm.c Histogrammer, der viser AF488 (knyttet til αS) eller Atto647N (knyttet til Tau) for forskellige proteinarter (dråber-D-, raft-R- og speckle-P) identificeret i FLIM-billeder optaget for αS-) timingfordelinger levetid for Tau441 og αS/ΔNt-Tau coacervate prøver (N = 17-32 ROI for D, 29-44 ROI for R og 21-51 ROI for point).Middel- og medianværdier vises som henholdsvis gule firkanter og sorte linjer inde i felter.De nedre og øvre grænser af boksen repræsenterer henholdsvis første og tredje kvartil, og minimums- og maksimumværdierne inden for 1,5-fold interkvartilområdet (IQR) vises som knurhår.Outliers vises som sorte diamanter.Statistisk signifikans mellem par af fordelinger blev bestemt ved hjælp af en to-stikprøve t-test, forudsat ulige varianser.To-halede t-test p-værdier er vist med stjerner for hvert par sammenlignede data (* p-værdi > 0,01, ** p-værdi > 0,001, *** p-værdi > 0,0001, **** p-værdi > 0,00001), ns Angiver negligibilitet (p-værdi > 0,05).De nøjagtige p-værdier er angivet i supplerende tabel 1, og de originale data præsenteres som rådatafiler.
For yderligere at demonstrere den amyloidlignende natur af pletter/aggregater behandlede vi ufarvede koacervatprøver i 24 timer med høje koncentrationer af (1 M) NaCl, hvilket resulterede i adskillelse af aggregater fra proteinkoacervater.Når isolerede aggregater (dvs. en dispergeret opløsning af aggregater) blev observeret ved hjælp af atomkraftmikroskopi (AFM), observerede vi en overvejende sfærisk morfologi med en regelmæssig højde på omkring 15 nm, som har tendens til at associere under forhold med høj saltkoncentration, svarende til opførselen af ​​typiske amyloidfibriller på grund af den stærke hydrofobe effekt på overfladen (bemærk at fibriller typisk har en højde på ~10 nm) (Supplerende Fig. 10a).Interessant nok, når isolerede aggregater blev inkuberet med ThT i et standard ThT fluorescensassay, observerede vi en dramatisk stigning i ThT fluorescens kvanteudbytte, sammenlignelig med det, der blev observeret, når farvestoffet blev inkuberet med typiske αS amyloidfibriller (Supplerende Fig. 10b), hvilket tyder på, at koacervataggregaterne indeholder amyloidlignende strukturer..Faktisk var aggregaterne tolerante over for høje saltkoncentrationer, men følsomme over for 4 M guanidinchlorid (GdnHCl), som typiske amyloidfibriller (Supplerende Fig. 10c).
Dernæst analyserede vi sammensætningen af ​​aggregaterne ved hjælp af enkeltmolekyle fluorescens, specifik fluorescenskorrelation/krydskorrelationsspektroskopi (FCS/FCCS) og burstanalyse af tofarvet koincidensdetektion (TCCD).Til dette formål isolerede vi aggregater dannet efter 24 timers inkubation i 100 μl LLPS-prøver indeholdende αS og Tau441 (begge 25 μM) sammen med 1 μM AF488-mærket αS og 1 μM Atto647N-mærket Tau4411.Fortynd den resulterende dispergerede aggregatopløsning til en monomolekylær tilstand ved hjælp af den samme PEG-fri buffer og 1 M NaCl (den samme buffer, der bruges til at adskille aggregater fra coacervat) for at forhindre enhver mulig elektrostatisk interaktion mellem LLPS og protein.Et eksempel på tidsbanen for et enkelt molekyle kan ses i fig. 7a.FCCS/FCS-analyse (krydskorrelation, CC og autokorrelation, AC) viste, at aggregater indeholdende αS og tau var rigelige i prøverne (se CC-kurven i fig. 7b, venstre panel), og et overskud af resterende monomert protein opstod som en resultat af fortyndingsprocessen (se AC-kurver i figur 7b, venstre panel).Kontroleksperimenter udført under de samme opløsningsbetingelser under anvendelse af prøver, der kun indeholdt monomere proteiner, viste ingen CC-kurver, og AC-kurverne passede godt til én-komponent diffusionsmodellen (Eq. 4), hvor monomere proteiner har de forventede diffusionskoefficienter (fig. 7b) ), højre panel).Diffusionskoefficienten for aggregerede partikler er mindre end 1 µm2/s, og den for monomere proteiner er ca. 1 µm2/s.50-100 µm/s;værdier svarer til tidligere offentliggjorte værdier for sonikerede αS amyloidfibriller og monomer αS separat under lignende opløsningsforhold44.Da vi analyserede aggregaterne med TCCD-eksplosionsanalyse (fig. 7c, øverste panel), fandt vi, at i hvert isoleret aggregat (αS/Tau-heteroaggregat) indeholdt omkring 60 % af de påviste aggregater både αS og tau, omkring 30 % indeholdt kun tau, kun ca. 10 % αS.Støkiometrisk analyse af αS/Tau-heteroaggregater viste, at de fleste af heteroaggregaterne var beriget med tau (støkiometri under 0,5, det gennemsnitlige antal tau-molekyler pr. aggregat er 4 gange mere end αS-molekyler), hvilket er i overensstemmelse med vores arbejde observeret i FLIM in situ eksperimenter..FRET-analyse viste, at disse aggregater indeholdt begge proteiner, selvom de faktiske FRET-værdier i dette tilfælde ikke er af stor betydning, da fordelingen af ​​fluoroforer i hvert aggregat var tilfældig på grund af et overskud af umærket protein anvendt i eksperimentet.Interessant nok, da vi udførte den samme analyse ved brug af den 45,46 modne amyloid-aggregering-deficiente Tau-variant (se Supplerende Fig. 11a,b), bemærkede vi, at selvom den elektrostatiske αS-aggregation var den samme (Supplerende Fig. 11c, d), evnen til at danne aggregater i koacervatet blev drastisk reduceret, og FLIM detekterede flere pletter i in situ eksperimenter, og svage krydskorrelationskurver blev observeret for isolerede aggregatprøver.For et lille antal påviste aggregater (kun en tiendedel af Tau441) observerede vi imidlertid, at hvert aggregat var beriget med αS end denne Tau-variant, idet ca. 50 % af de påviste aggregater kun indeholdt αS-molekyler, og αS var heterogent i overskud .aggregater (se Supplerende Fig. 11e), i modsætning til de heterogene aggregater genereret af Tau441 (Fig. 6f).Resultaterne af disse eksperimenter viste, at selvom αS selv er i stand til at akkumulere med tau i coacervatet, er tau-kernedannelse mere gunstig under disse betingelser, og de resulterende amyloidlignende aggregater er i stand til at fungere som en form for αS og tau.Men når først en tau-rig kerne er dannet, foretrækkes heterotypiske interaktioner mellem αS og tau i aggregater frem for homotypiske interaktioner mellem tau-molekyler;vi observerer også proteinnetværk i flydende αS/tau-koacervater.
a Repræsentative fluorescerende tidsmæssige spor af enkelte molekyler af isolerede aggregater dannet i αS/Tau441 elektrostatiske koacervater.Bursts svarende til αS/Tau441 koaggregater (bursts over den angivne tærskel) blev observeret i tre detektionskanaler (AF488 og Atto647N emission efter direkte excitation, blå og røde linjer, Atto647N emission efter indirekte excitation), FRET, violet linje).b FCS/FCCS-analyse af en prøve af isolerede αS/Tau441-aggregater opnået fra LLPS (venstre panel).Autokorrelation (AC) kurver for AF488 og Atto647N er vist i henholdsvis blå og rød, og krydskorrelation (CC) kurver forbundet med aggregater indeholdende begge farvestoffer er vist i lilla.AC-kurverne afspejler tilstedeværelsen af ​​mærkede monomere og aggregerede proteinarter, mens CC-kurverne kun viser diffusionen af ​​dobbeltmærkede aggregater.Den samme analyse, men under de samme opløsningsbetingelser som i isolerede pletter, er prøver, der kun indeholder monomert αS og Tau441, vist som kontroller i højre panel.c Fluorescensflashanalyse af enkelte molekyler af isolerede aggregater dannet i αS/Tau441 elektrostatiske koacervater.Information for hvert aggregat fundet i fire forskellige gentagelser (N = 152) er plottet mod deres støkiometri, S-værdier og FRET-effektivitet (øverste panel, farvebjælke afspejler forekomst).Der kan skelnes mellem tre typer aggregater: -αS-kun aggregater med S~1 og FRET~0, Tau-only aggregater med S~0 og FRET~1, og heterogene Tau/αS aggregater med mellemliggende S og FRET Estimater af mængden af begge markørproteiner påvist i hvert heterogent aggregat (N = 100) er vist i det nederste panel (farveskalaen afspejler forekomsten).Rådata leveres i form af rådatafiler.
Modningen eller ældningen af ​​flydende proteinkondensater til gel-lignende eller faste strukturer over tid er blevet rapporteret at være involveret i adskillige fysiologiske funktioner af kondensatet47 såvel som i sygdom, som en unormal proces forud for amyloidaggregering 7, 48, 49. Her vi studerer faseadskillelse og adfærd i detaljer.LSPT αS i nærvær af tilfældige polykationer i et kontrolleret miljø ved lave mikromolære koncentrationer og fysiologisk relevante forhold (bemærk, at den beregnede fysiologiske koncentration af αS er >1 µM50), efter typisk termodynamisk drevet opførsel af LPS.Vi fandt ud af, at αS, som indeholder en meget negativt ladet C-terminal region ved fysiologisk pH, er i stand til at danne proteinrige dråber i vandig opløsning via LLPS i nærvær af stærkt kationiske forstyrrede peptider såsom pLK eller Tau gennem processen med elektrostatisk kompleks kondensation i nærvær af aggregeringsmakromolekyler.Denne proces kan have relevante virkninger i det cellulære miljø, hvor αS møder forskellige polykationiske molekyler forbundet med dets sygdomsassocierede aggregering både in vitro og in vivo51,52,53,54.
I mange undersøgelser er proteindynamik i dråber blevet betragtet som en af ​​nøglefaktorerne, der bestemmer modningsprocessen55,56.I elektrostatiske αS-koacervater med polykationer afhænger modningsprocessen tilsyneladende af styrken af ​​interaktioner med polykationer, valensen og mangfoldigheden af ​​disse interaktioner.Ligevægtsteori antyder, at et ligevægtslandskab af to flydende tilstande ville være tilstedeværelsen af ​​en stor dråbe rig på biopolymerer, der driver LLPS57,58.Dråbevækst kan opnås ved Ostwald-modning59, koalescens60 eller forbrug af fri monomer i den dispergerede fase61.For αS og Tau441, ΔNt-Tau eller pLK blev det meste af proteinet koncentreret i kondensatet under betingelserne anvendt i denne undersøgelse.Mens tau-dråber i fuld størrelse koaleserede hurtigt ved overfladebefugtning, var dråbesammensmeltning og befugtning imidlertid vanskelig for ΔNt-Tau og pLK, hvilket tyder på et hurtigt tab af væskeegenskaber i disse to systemer.Ifølge vores FLIM-FRET-analyse viste de gamle pLK- og ΔNt-Tau-dråber en lignende grad af proteinaggregering (lignende fluorescenslevetid) som de originale dråber, hvilket tyder på, at det oprindelige proteinnetværk blev bibeholdt, omend mere stift.
Vi rationaliserer vores eksperimentelle resultater i følgende model (figur 8).De oprindeligt midlertidigt dannede dråber er ofte proteinnetværk uden elektrostatisk kompensation, og der er således områder med ladningsubalance, især ved dråbegrænsefladen, hvilket resulterer i dråber med et højt elektrostatisk overfladepotentiale.For at kompensere for ladning (et fænomen, der almindeligvis omtales som valensudtømning) og minimere overfladepotentialet af dråberne, kan dråberne inkludere nye polypeptider fra den fortyndede fase, reorganisere proteinnetværk for at optimere ladnings-ladningsinteraktioner og interagere med andre dråber.med overflader (befugtning).αS/pLK-dråberne synes på grund af deres simplere proteinnetværk (kun heterotypiske interaktioner mellem αS og pLK) og større affinitet for protein-protein-interaktioner at være i stand til at afbalancere ladningen af ​​kondensatet hurtigere;faktisk observerede vi hurtigere proteinkinetik i oprindeligt dannede αS/pLK-koacervater end i αS/Tau.Efter valensudtømning bliver interaktionerne mindre flygtige, og dråberne mister deres væskeegenskaber og bliver til gel-lignende, ikke-brændbare dråber med et lavt elektrostatisk overfladepotentiale (og derfor ude af stand til at fugte overfladen).I modsætning hertil er αS/Tau-dråber mindre effektive til at optimere dråbeladningsbalancen på grund af mere komplekse proteinnetværk (med både homotypiske og heterotypiske interaktioner) og den svagere karakter af proteininteraktioner.Dette resulterer i dråber, der bevarer væskeadfærden i længere perioder og udviser et højt elektrostatisk overfladepotentiale, der har tendens til at blive minimeret ved at samles og vokse (derved minimere forholdet mellem overfladeareal og volumen af ​​dråberne) og ved at fugte den hydrofile overfladekemikalie.Dette skaber store koncentrerede proteinbiblioteker, der bevarer væskeegenskaber, da interaktionerne forbliver meget forbigående på grund af den konstante søgen efter ladningsoptimering i proteinnetværket.Interessant nok udviser N-terminalt trunkerede former af Tau, inklusive nogle naturligt forekommende isoformer62, mellemliggende adfærd, hvor nogle coacervater ældes med αS til langlivede gel-lignende dråber, mens andre omdannes til store flydende kondensater.Denne dualitet i modningen af ​​αS elektrostatiske koacervater er i overensstemmelse med nyere LLPS teoretiske og eksperimentelle undersøgelser, der har identificeret en sammenhæng mellem valensudtømning og elektrostatisk sigtning i kondensat som en nøgle til at kontrollere kondensatstørrelse og væskeegenskaber.Mekanisme 58,61.
Dette skema viser den formodede amyloid-aggregationsvej for αS og Tau441 via LLPS og LSPT.Med yderligere anionrige (røde) og kationrige (blå) områder har αS og tau elektrostatiske koacervater med tilfredsstillende valens lavere overfladeenergi og derfor mindre koalescens, hvilket resulterer i hurtig dråbeældning.En stabil ikke-agglomereret geltilstand opnås..Denne situation er meget gunstig i tilfælde af αS/pLK-systemet på grund af dets højere affinitet og enklere protein-par-interaktionsnetværk, som muliggør en hurtig gel-lignende overgang.Tværtimod gør dråber med utilfredsstillende valens og derfor proteinladede områder, der er tilgængelige for interaktion, det lettere for coacervatet at fusionere og fugte den hydrofile overflade for at reducere dens høje overfladeenergi.Denne situation er at foretrække for αS/Tau441-koacervater, som har et multivalent komplekst netværk bestående af svage Tau-Tau- og αS-Tau-interaktioner.Til gengæld vil større koacervater lettere bevare deres væskelignende egenskaber, hvilket tillader andre protein-til-protein-interaktioner at forekomme.Til sidst dannes amyloide heterogene aggregater indeholdende både αS og tau i coacervatvæsken, som kan være relateret til dem, der findes i inklusionslegemer, som er kendetegnende for neurodegenerative sygdomme.
De store væskelignende strukturer dannet under modning af αS/Tau441 med et stærkt overbelastet, men dynamisk proteinmiljø og, i mindre grad, αS/ΔNt-Tau-koacervater er ideelle reservoirer til nukleering af proteinaggregering.Vi har faktisk observeret dannelsen af ​​faste proteinaggregater i denne type proteinkoacervater, der ofte indeholder både αS og tau.Vi har vist, at disse heteroaggregater stabiliseres af ikke-elektrostatiske interaktioner, er i stand til at binde amyloid-specifikke ThT-farvestoffer på samme måde som typiske amyloidfibriller og faktisk har lignende modstand mod forskellige påvirkninger.αS/tau-aggregaterne dannet af LLPS blev vist at have amyloidlignende egenskaber.Faktisk er den modne variant af Tau, der mangler amyloid-aggregering, væsentligt svækket i dannelsen af ​​disse heterogene αS-aggregater i det flydende elektrostatiske koacervat.Dannelsen af ​​αS/Tau441-aggregater blev kun observeret inde i coacervaterne, som bibeholdt væskelignende egenskaber, og aldrig, hvis coacervaterne/dråberne ikke nåede geltilstanden.I sidstnævnte tilfælde forhindrer den øgede styrke af elektrostatiske interaktioner og som et resultat stivheden af ​​proteinnetværket de nødvendige konformationelle omlejringer af proteiner for at etablere nye proteininteraktioner, der er nødvendige for amyloidkernedannelse.Dette kan dog opnås i mere fleksible, væskelignende coacervater, som igen er mere tilbøjelige til at forblive flydende, når de øges i størrelse.
Det faktum, at dannelsen af ​​aggregater i den kondenserede fase er at foretrække i store αS/Tau-kondensater end i små dråber, der hurtigt gelerer, fremhæver relevansen af ​​at identificere de faktorer, der styrer dråbesammensmeltning.Der er således ikke kun en tendens til faseadskillelse, men størrelsen af ​​kondensatet skal kontrolleres for korrekt funktion samt sygdomsforebyggelse58,61.Vores resultater fremhæver også vigtigheden af ​​balancen mellem LLPS og LSPT for αS/Tau-systemet.Mens dråbedannelse kan beskytte mod amyloidaggregering ved at reducere mængden af ​​tilgængelige proteinmonomerer under mætningsbetingelser, som det er blevet foreslået i andre systemer63,64, kan dråbefusion ved høje dråbeniveauer føre til intern proteinaggregering gennem langsomme konformationelle omlejringer.protein netværk..
Samlet set understreger vores data stærkt relevansen af ​​sammenhængende valens og tilfredse/utilfredse interaktioner i drop-netværk i forbindelse med LSPT.Især viser vi, at αS/Tau441-kondensater i fuld længde er i stand til effektivt at fusionere og nukleere for at danne amyloidlignende heteroaggregater, der inkluderer både proteiner og foreslår en molekylær mekanisme baseret på vores eksperimentelle resultater.Den co-aggregering af to proteiner i αS/Tau-væske-koacervatet, som vi rapporterer her, kan faktisk være relateret til co-lokaliseringen af ​​to proteiner i inklusioner, som er kendetegn for sygdommen, og kan bidrage til at forstå sammenhængen mellem LLPS og amyloid aggregering, hvilket baner vejen for højt ladet IDP i neurodegeneration.
Monomer WT-αS, cysteinmutanter (Q24C-αS, N122C-αS) og ΔCt-αS varianter (Δ101-140) blev udtrykt i E. coli og oprenset som tidligere beskrevet.5 mM DTT blev inkluderet i alle trin i oprensningen af ​​αS-cysteinmutanter for at forhindre disulfidbindingsdannelse.Tau441-isoform (plasmid opnået fra Addgene #16316), ΔNt-Tau-variant (Δ1-150, opnået ved kloning af IVA med primere CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) og AggDef-2CT-oprenset variant med EGGDef-2CT,7C5-variant-1CT5,5C. coli-kulturer var dyrket til OD600 = 0,6-0,7 ved 37°C og 180 rpm, og ekspression blev induceret med IPTG i 3 timer ved 37°C.Høst celler ved 11.500 xg i 15 minutter ved 4 °C og vask med saltvandsbuffer indeholdende 150 mM NaCl.Resuspender pelleten i lysisbuffer (20 ml pr. 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidin 50 μM, copeptin 100).Sonikeringstrinnet blev udført på is med en amplitude på 80 % i 10 pulser (1 min tændt, 1 min slukket).Må ikke overstige 60 ml i en ultralyd.E. coli-lysater blev opvarmet ved 95°C i 20 minutter, derefter afkølet på is og centrifugeret ved 127.000 xg i 40 minutter.Den klarede supernatant blev påført en 3,5 kDa membran (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) og dialyseret mod 4 L dialysebuffer (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM PMSF 0,1 mM) i 10 timer.En 5 ml kationbyttersøjle (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) blev ækvilibreret med ækvilibreringsbuffer (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau-lysatet blev filtreret gennem et 0,22 μm PVDF-filter og injiceret i søjlen med en strømningshastighed på 1 ml/min.Eluering blev udført gradvist, tau blev elueret med 15-30% elueringsbuffer (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Fraktioner blev analyseret ved SDS-PAGE, og eventuelle fraktioner indeholdende et bånd med den forventede molekylvægt af tau blev koncentreret ved anvendelse af et 10 kDa centrifugefilter og erstattet med en buffer indeholdende 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM og DTT 2 mM for den endelige proteinkoncentration var 100 μM.Proteinopløsningen blev derefter ført gennem et 0,22 μm PVDF-filter, hurtigt frosset og opbevaret ved -80°C.Protein K18 blev venligt leveret af prof. Alberto Boffi.Renheden af ​​præparatet var >95% som bekræftet af SDS-PAGE og MALDI-TOF/TOF.Forskellige cysteiner blev kemisk mærket med AlexaFluor488-maleimid (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) eller TEMPOL-maleimid (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).blev bekræftet ved absorbans og MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau og K18 blev mærket med native cysteinrester i positionerne 191 og 322 under anvendelse af Atto647N-maleimid (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Tyskland) efter samme procedure.Nettoladning pr. rest-kort for αS og Tau441 blev genereret under anvendelse af CIDER66.
Fast poly-L-lysin (pLK DP 90-110 ifølge NMR fra leverandør, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) blev opløst i 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 til 10 mM koncentration, processonikeret i 5 minutter i et ultralydsvandbad og opbevares ved -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) og FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) er vandopløselige og bredt fordelt i LLPS-buffer.Dialyse fjerner forurenende salte.De blev derefter filtreret gennem et sprøjtefilter med en porestørrelse på 0,22 μm, og deres koncentrationer blev beregnet ved hjælp af et refraktometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).LLPS-prøver blev fremstillet ved stuetemperatur i følgende rækkefølge: buffer og ekstrudering blev blandet og 1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(ethan- 1,2-diyldinitril) tetraeddikesyre (EDTA, carboxynth) og en blanding af 1% proteaseinhibitor (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptin 5 μM).Derefter tilføjes αS og fusionerede polykationer (valgmuligheder pLK eller Tau).Til thioflavin-T-tidsserieeksperimenter (ThT, Carbosynth, Compton, UK), brug den samlede ThT-koncentration til at være halvdelen af ​​αS-koncentrationen.Bland forsigtigt, men grundigt prøverne for at sikre, at de er homogene.Koncentrationen af ​​hver komponent varierede fra eksperiment til eksperiment, som beskrevet i afsnittet Resultater.Azid blev anvendt i en koncentration på 0,02 % (vægt/volumen), når varigheden af ​​eksperimentet oversteg 4 timer.For alle analyser med LLPS-prøver, lad blandingen ækvilibrere i 5 minutter før analyse.Til lysspredningsanalyse blev 150 µl prøver sat på ikke-bindende 96-brønds mikroplader (µClear®, sort, F-bund/skorstensbrønd, Greiner bio-one, Kremsmünster, Østrig) og dækket med klæbende film.LLP'er blev overvåget ved at måle absorbans ved 350 nm i midten af ​​opløsningen i en CLARIOstar pladelæser (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland).Forsøgene blev udført i tre eksemplarer ved 25°C, og fejlene blev beregnet som standardafvigelsen fra middelværdien.Den fortyndede fase blev kvantificeret ved prøvecentrifugering og SDS-PAGE-gelanalyse, og αS-fraktionen i de fortyndede og koncentrerede faser blev kvantificeret i forskellige LLPS-opløsninger.En 100 μl LLPS-prøve indeholdende 1 μM AF488-mærket αS blev fremstillet ved grundig blanding efterfulgt af centrifugering ved 9600×g i 30 minutter, hvorefter bundfaldet normalt var synligt.De øverste 50 μl af supernatanten blev brugt til proteinkvantificering ved hjælp af SDS-PAGE-gel.Geler blev scannet med AF488-filtre ved hjælp af et ChemiDoc-gelbilleddannelsessystem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) eller farvet med Coomassie-farve og visualiseret med passende filtre.De resulterende bånd blev analyseret ved hjælp af ImageJ version 1.53i (National Institutes of Health, USA).Forsøgene blev udført i to eksemplarer i to forskellige forsøg med lignende resultater.
Typisk blev 150 μl prøver påført på ikke-bindende 96-brønds mikroplader og visualiseret ved stuetemperatur på et Leica DMI6000B omvendt mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland).Til pleteksperimenter blev µ-Slide Angiogenesis plader (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Tyskland) eller 96-brønds polystyren mikroplader (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) også brugt.EL6000 halogen- eller kviksølvmetalhalogenlamper blev brugt som belysningskilder (til henholdsvis BF/DIC- og WF-billeddannelse).Til WF-mikroskopi blev et luftobjektiv med 40x forstørrelse (Leica Microsystems, Tyskland) brugt til at fokusere lyset på prøven og opsamle det.For AF488- og ThT-mærkede prøver, filterexcitation og -emission med standard GFP-filtersæt, excitations- og emissionsbåndpasfiltre, henholdsvis 460-500 nm og 512-542 nm båndpasfiltre og et 495 nm dikroisk spejl.For prøver mærket med Atto647N blev der brugt et standardsæt af Cy5-filtre med excitations- og emissionsbåndpasfiltre 628-40 nm og 692-40 nm, og et 660 nm dikroisk spejl.Til BF- og DIC-mikroskopi skal du bruge det samme objektiv til opsamling af reflekteret lys.Det opsamlede lys blev optaget på et Leica DFC7000 CCD-kamera (Leica Microsystems, Tyskland).Eksponeringstiden var 50 ms for BF- og DIC-mikroskopi-billeddannelse og 20-100 ms for WF-mikroskopi-billeddannelse.Til sammenligning var eksponeringstiden for alle forsøg med ThT 100 ms.Time-lapse eksperimenter blev udført for at visualisere dråbesammensmeltning, hvor billeder blev indsamlet hver 100 ms i flere minutter.ImageJ (NIH, USA) blev brugt til billedanalyse.Forsøgene blev udført i tre eksemplarer med lignende resultater.
Til kolokaliseringseksperimenter, FRAP og 3D-rekonstruktion blev billeder erhvervet på et Zeiss LSM 880 inverteret konfokalmikroskop ved hjælp af en ZEN 2 blå udgave (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Tyskland).Prøver på 50 µl blev påført µ-Slide Angiogenesis Petriskåle (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Tyskland), behandlet med en hydrofil polymer (ibiTreat) og monteret i et 63× olienedsænkningsobjektiv (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) på DIC).Billeder blev optaget ved brug af 458 nm, 488 nm og 633 nm argon-laserlinjer med en opløsning på 0,26 µm/pixel og en eksponeringstid på 8 µs/pixel for excitations- og emissionsdetektionsvinduer på 470-600 nm, 493-nm, 628 og 638-755 nm blev brugt til at visualisere henholdsvis ThT, AF488 og Atto647N.Til FRAP-eksperimenterne blev time-lapse-fotografering af hver prøve optaget med 1 billede pr. sekund.Forsøgene blev udført i tre eksemplarer ved stuetemperatur med lignende resultater.Alle billeder blev analyseret ved hjælp af Zen 2 blue edition software (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Tyskland).FRAP-kurverne blev normaliseret, plottet og tilpasset til intensitets-/tidsdata ekstraheret fra billeder ved hjælp af Zen 2 ved brug af OriginPro 9.1.Genvindingskurverne blev tilpasset til en mono-eksponentiel model for at tage højde for molekylær diffusion med et ekstra eksponentielt udtryk for at tage højde for den optagelige blegeeffekt.Vi beregnede derefter D ved hjælp af den nominelle blegningsradius og den tidligere bestemte halveringstid for genvinding som i ligningen af ​​Kang et al.5 35 vist.
Enkelte cysteinvarianter af αS blev syntetiseret med 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-N-oxyl (TEMPOL) i position 24 (TEMPOL-24-αS) og 122 (TEMPOL-122-αS), henholdsvis.Spin-mærkning For EPR-eksperimenter blev αS-koncentrationen indstillet til 100 μM, og PEG-koncentrationen var 15 % (vægt/volumen).For forskellige aggregeringsbetingelser var αS:pLK-forholdet 1:10, mens αS:ΔNt-Tau- og αS:Tau441-forholdet blev opretholdt på 1:1.Til bindingstitreringseksperimenter i fravær af trængsel blev TEMPOL-122-αS opretholdt på 50 μM, og polykationer blev titreret ved stigende koncentrationer, idet hver tilstand blev forberedt separat.CW-EPR-målinger blev udført under anvendelse af et Bruker ELEXSYS E580 X-band spektrometer udstyret med en Bruker ER4118 SPT-N1 resonator, der opererer ved en mikrobølge (SHF) frekvens på ~9,7 GHz.Temperaturen blev indstillet til 25°C og styret af en flydende nitrogenkryostat.Spektrene blev opnået under umættede forhold ved en MW-effekt på 4 mW, en modulationsamplitude på 0,1 mT og en modulationsfrekvens på 100 kHz.Spektralintensiteter blev normaliseret for at undgå forskelle i spinkoncentrationer mellem prøver og mulig spinreduktion på grund af resterende koncentrationer af reduktionsmidler i prøver indeholdende Tau441 eller ΔNt-Tau (til stede i de originale proteinopløsninger).De givne værdier for g blev opnået som et resultat af EPR-spektralmodellering udført ved hjælp af Easyspin-softwaren (v. 6.0.0-dev.34) implementeret i Matlab®67.En/to-komponent isotrope modeller blev brugt til at modellere dataene.Efter normalisering af alle signaler blev resterne beregnet ved at trække hver simulering fra det tilsvarende eksperimentelle spektrum.Til bindingstitreringsanalyse blev den relative intensitet af det tredje bånd til det andet bånd af det normaliserede EPR-spektrum (IIII/III) anvendt til at overvåge bindingen af ​​polykationer til αS.For at estimere dissociationskonstanten (Kd) blev den resulterende kurve tilpasset til en omtrentlig model, der antog n identiske og uafhængige bindingssteder.
NMR-spektroskopi-eksperimenter blev udført under anvendelse af et Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR-spektrometer udstyret med en kryoprobe og Z-gradient.Alle eksperimenter blev udført under anvendelse af 130-207 µM αS og tilsvarende αS/ΔNt-Tau- og pLK-ækvivalenter i 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 og blev udført ved 15°C.For at overvåge LPS ved NMR blev 10 % PEG tilsat til de forblandede prøver.Det kemiske skift-forstyrrelsesplot (fig. 1b) viser de gennemsnitlige 1H og 15N kemiske skift.αS 2D1H-15N HSQC-spektrene blev tildelt baseret på en tidligere tildeling (BMRB-post #25227) og bekræftet ved at optage og analysere 3D-spektrene for HNCA, HNCO og CBCAcoNH.13Cα og 13Cβ kemiske skift blev beregnet i nærvær af ΔNt-Tau eller pLK for at måle mulige ændringer i sekundære strukturtendenser sammenlignet med αS kemiske skift i ren tilfældig spolekonformation 68 (Supplerende figur 5c).R1ρ-hastighederne blev målt ved at optage hsqctretf3gpsi-eksperimenter (opnået fra Bruker-biblioteket) med forsinkelser på 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 og 800 ms, og de eksponentielle funktioner blev justeret til spidsintensitetsforsinkelserne gange for at bestemme R1ρ og dens eksperimentelle usikkerhed.
To-farve tidsopløst fluorescensmikroskopi eksperimenter blev udført på et kommercielt tidsopløst MT200 fluorescens konfokalt mikroskop (PicoQuant, Berlin, Tyskland) med en tidskorreleret enkelt foton tælling (TCSPC) enhed.Laserdiodehovedet bruges til pulseret interleaved excitation (PIE), strålen passerer gennem en single mode bølgeleder og er indstillet til en lasereffekt på 10 til 100 nW for 481 nm og 637 nm laserlinjer målt efter et dikroisk spejl.Dette sikrer en optimal fotonoptællingshastighed og undgår virkningerne af fotonaliasing, fotoblegning og mætning.μ-Slide angiogenese dækglas eller plader (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Tyskland) blev placeret direkte i nedsænkningsvand over en Super Apochromat 60x NA 1.2 linse med en korrigerende krave (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Et 488/640 nm dikroisk spejl (Semrock, Lake Forest, IL, USA) blev brugt som hovedstråledeleren.Ufokuseret stråling blokeres af et hul med en diameter på 50 mikron, derefter opdeles den fokuserede stråling i 2 detektionsbaner af en 50/50 stråledeler.Båndpas-emissionsfiltre (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 for grønt farvestof (AF488) og 690/70 for rødt farvestof (Atto647N) blev brugt foran detektoren.Enkeltfoton lavinedioder (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italien) blev brugt som detektorer.Både dataindsamling og analyse blev udført ved hjælp af den kommercielt tilgængelige SymphoTime64-software (PicoQuant GmbH, Berlin, Tyskland).
Halvtreds mikroliter LLPS-prøver blev påført μ-Slide angiogenesebrønde (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Tyskland).De resulterende billeder er fokuseret til 20 µm over brøndbunden for optimal objektiv arbejdsafstand for suspenderede dråber og til ~1 µm for flåder og prikker med en aksial opløsning på mindst 0,25 µm/pixel og en forsinkelsestid på 400 µs/pixel.Vælg data ved at anvende en intensitetstærskel baseret på den gennemsnitlige baggrundssignalintensitet (PBG, middelværdi + 2σ) for hver kanal, så kun flydende proteindråber, flåder eller pletter udvælges, hvilket filtrerer enhver mulig oprindelse fra den dispergerede fase.For at analysere levetiden for hver art (τ) af hver kanal (grøn, "g" for AF488 og rød, "r" for Atto647N), valgte vi regioner af interesse (ROI'er) indeholdende dråber, flåder eller pletter (Supplerende figur 1) ).8b) og udledte dem ved at tilpasse deres livstidsforfald (τD, τR og τP for henholdsvis dråber, flåder eller pletter, se Supplerende Fig. 8c) i hver kanal ved hjælp af en haletilpasningsanalyse og en to-komponent henfaldsmodel.Gennemsnit τ fra τ .ROI'er, der producerede for få fotoner til en multi-eksponentiel tilpasning, blev udelukket fra analysen.Den anvendte cutoff var <104 fotoner for flåder og prikker og 103 for fald.Dråberne har en lavere tærskel, fordi det er vanskeligt at opnå henfaldskurver med højere intensitetsværdier, da dråberne i billedfeltet normalt er mindre og mindre talrige.ROI'er med fotontællinger over fotonakkumuleringsgrænsen (indstillet til >500 tællinger/pixel) blev også kasseret til analyse.Match intensitetshendingskurven opnået fra området af interesse med en intensitet på 90 % af maksimum (lidt efter den maksimale intensitet af henfaldet) fra begyndelsen af ​​levetiden for at sikre minimal IRF-interferens, samtidig med at den samme opretholdes for al intensitetsfald indstillinger Relativt tidsvindue Blev analyseret 25 til 50 ROI for rafts og spots og 15-25 ROI for drops, billeder valgt fra mere end 4 replikater optaget fra mindst 3 uafhængige eksperimenter.To-halede t-tests er blevet brugt til at evaluere statistiske forskelle mellem arter eller mellem koacervatsystemer.Til en pixel-for-pixel-analyse af levetiden (τ) blev den totale dæmpning af levetiden over feltet for hver kanal beregnet, og en tilnærmelse af en 2/3-komponent eksponentiel dæmpningsmodel blev udført.Livstidsdæmpningen for hver pixel blev derefter tilpasset ved hjælp af tidligere beregnede τ-værdier, hvilket resulterede i et pseudofarvet FLIM-tilpasningsbillede.Haletilpasningslevetiden var den samme på tværs af alle billeder af den samme kanal, og hvert henfald producerede nok fotoner til at give en pålidelig pasform.Til FRET-analyse blev pixels udvalgt ved at anvende en lavere intensitetstærskel på 100 fotoner, som i gennemsnit var et baggrundssignal (FBG) på 11 fotoner.Fluorescensintensiteten af ​​hver kanal blev korrigeret ved eksperimentelt bestemte korrektionsfaktorer: 69 spektral krydstale α var 0,004, direkte excitation β var 0,0305, detektionseffektivitet γ var 0,517.FRET-effektiviteten på pixelniveau beregnes derefter ved hjælp af følgende ligning:
hvor FDD er fluorescensintensiteten observeret i donorkanalen (grøn), FDA er fluorescensintensiteten observeret i acceptorkanalen (rød) under indirekte excitation, og FAA er fluorescensintensiteten observeret i acceptorkanalen (rød) under direkte excitation ( PIE).Fluorescensintensitetsimpulser observeres i kanalen).
Anbring 100 µl LLPS-reaktionsopløsninger indeholdende 25 µM umærket monomer Tau441 (med eller uden 25 µM αS) i LLPS-buffer (suppleret som ovenfor) på ikke-bindende 96-brønds mikroplader med klæbende foliebelægning og dråbedannelse blev kontrolleret ved WF-mikroskopi ligevægt.inden for 10 min.Efter 48 timers inkubation ved stuetemperatur blev tilstedeværelsen af ​​proteinflåder og pletter bekræftet.Fjern derefter forsigtigt væsken over flåderne fra brøndene, tilsæt derefter 50 L dissociationsbuffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) og inkuber i 10 min.Den høje saltkoncentration sikrer, at LLPS ikke gentages på grund af resterende PEG, og mulige proteinsamlinger, der kun er dannet af elektrostatiske interaktioner, vil blive adskilt.Bunden af ​​brønden blev derefter forsigtigt skrabet af med en mikropipettespids, og den resulterende opløsning blev overført til en tom observationsbrønd.Efter inkubation af prøverne med 50 μM ThT i 1 time blev tilstedeværelsen af ​​isolerede pletter kontrolleret ved WF-mikroskopi.Forbered sonikerede αS-fibriller ved at inkubere 300 µl af en 70-µM αS-opløsning i PBS med pH 7,4, natriumazid 0,01% ved 37 °C og 200 rpm på en orbitalryster i 7 dage.Opløsningen blev derefter centrifugeret ved 9600 xg i 30 minutter, pelleten blev resuspenderet i PBS pH 7,4 og sonikeret (1 min, 50 % cyklus, 80 % amplitude i en Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) fibrilprøver med en relativt ensartet størrelsesfordeling af små fibriller.
FCS/FCCS-analyse og to-farve-sammenfaldsdetektion (TCCD) blev udført på det samme MT200 tidsopløste fluorescerende konfokale mikroskop (Pico-Quant, Berlin, Tyskland), som blev brugt til FLIM-FRET mikroskopi-eksperimenter ved brug af PIE-tilstand.Lasereffekten til disse eksperimenter blev tilføjet til 6,0 µW (481 nm) og 6,2 µW (637 nm).Kombinationen af ​​disse laserkræfter blev valgt til at producere lignende lysstyrke for de anvendte fluoroforpar, samtidig med at der blev opnået optimale tællehastigheder og undgået fotoblegning og mætning.Både dataindsamling og analyse blev udført ved hjælp af den kommercielt tilgængelige SymphoTime64 version 2.3-software (PicoQuant, Berlin, Tyskland).
Prøver af isolerede αS/Tau-aggregater opnået under anvendelse af LLPS fortyndes i isoleringsbuffer til den passende monomolekylære koncentration (typisk en 1:500-fortynding, da aggregater allerede er i lave koncentrationer, når de isoleres fra coacervatprøver).Prøver blev påført direkte på dækglas (Corning, USA) præcoatet med en BSA-opløsning i en koncentration på 1 mg/ml.
Til PIE-smFRET-analysen i de grønne og røde kanaler blev en lavere intensitetstærskel på 25 fotoner anvendt for at filtrere lavintensitetssignaler forårsaget af monomere hændelser (bemærk, at monomerer overstiger aggregerede prøver sammenlignet med isolerede aggregater).Denne tærskel blev beregnet som fem gange den gennemsnitlige intensitet af monomert αS opnået fra analysen af ​​rene monomerprøver for specifikt at vælge aggregater til analyse.PIE-drevkredsløbet har sammen med TSCPC-dataindsamling muliggjort anvendelsen af ​​et livstidsvægtningsfilter, der hjælper med at eliminere baggrund og spektral krydstale.Flare-intensiteten valgt ved hjælp af ovenstående tærskelværdier blev korrigeret ved hjælp af det gennemsnitlige baggrundssignal bestemt ud fra histogrammerne for forekomst versus intensitet/bin af prøverne med kun buffer.Bursts forbundet med store aggregater optager typisk flere på hinanden følgende bins i tidssporet (indstillet til 1 ms).I disse tilfælde blev der valgt en beholder med maksimal styrke.Til FRET og støkiometrisk analyse blev den teoretisk bestemte gammafaktor y (0,517) brugt.Spektral krydstale og direkte excitationsbidrag er ubetydelige (bestemt eksperimentelt) ved den anvendte excitationslasereffekt.Effektiviteten og støkiometrien af ​​FRET i en eksplosion beregnes som følger.