310 10*1mm rustfrit stål oprullet rør kemisk komponent, de N-terminale domæner af spidroin danner hydrogeler baseret på amyloidfibriller og giver en platform for proteinimmobilisering.

Tak fordi du besøgte Nature.com.Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).For at sikre løbende support viser vi desuden siden uden styles og JavaScript.
Sliders, der viser tre artikler pr. slide.Brug tilbage- og næste-knapperne til at flytte gennem diasene, eller dias-controllerknapperne i slutningen til at flytte gennem hvert dias.

Specifikation

310 10*1mm Rustfrit stål spiralrør leverandører

Kemisk sammensætning

Mekaniske egenskaber

Rekombinante edderkoppesilkeproteiner (edderkoppesilkeproteiner) har mange potentielle anvendelser i udviklingen af ​​nye biomaterialer, men deres multimodale og aggregeringstilbøjelige natur gør dem vanskelige at opnå og nemme at bruge.Her rapporterer vi, at rekombinante miniature spidroinproteiner og, hvad der er vigtigt, selve det N-terminale domæne (NT) hurtigt danner selvbærende og gennemsigtige hydrogeler ved 37 ° C.fusionsproteiner bestående af NT og grønt fluorescerende protein eller purin-nukleosid-phosphorylase danner fuldt funktionelle fusionsproteiner.Hydrogeler.Vores resultater viser, at rekombinante NT- og fusionsproteiner giver høje ekspressionsudbytter og giver hydrogeler attraktive egenskaber såsom gennemsigtighed, gelering uden tværbinding og direkte immobilisering af aktive proteiner ved høj densitet.
Edderkopper har så mange som syv forskellige sæt silkekirtler, der hver producerer en bestemt type silke.Alle syv silkearter er sammensat af edderkoppesilkeproteiner (spidroiner) ca. 6000 rester lange og indeholder et stort centralt gentagelsesområde omgivet af sfæriske N- og C-terminale domæner (NT og CT)1,2.Den mest undersøgte type silke, den primære ampulla, produceres af den primære ampullakirtel.I denne kirtel syntetiserer et monolag af epitelceller spidroinproteiner og udskiller dem i kirtlens lumen, hvor de er til stede i en opløselig form (doping) i ekstremt høje koncentrationer (30-50% w/v)3,4.Organisationen og konformationen af ​​de vigtigste ampulære spidroinproteiner i kirtlen er blevet diskuteret, men de fleste eksperimentelle beviser indikerer tilstedeværelsen af ​​en generelt spiralformet og/eller tilfældig spiralformet konformation og micellære eller lamellære strukturer5,6,7,8,9,10.Mens de gentagne domæner regulerer silkefibres mekaniske egenskaber, danner β-sheet nanokrystaller og amorfe strukturer11,12,13,14,15, regulerer endedomæner silkefibre som svar på skiftende forhold langs silkekirtlen16,17,18.Ved at kontrollere silkedannelsen er 19. Terminale domæner evolutionært konserverede, og deres funktion kan være fælles for alle spidroinproteiner 2,20,21.Under passage gennem kirtlen falder spidroins pH fra ca. 7,6 til < 5,716 og stiger med forskydning og stræk medieret af bevægelse gennem den gradvist indsnævrede kanal.I opløsning er CT en α-spiralformet konstitutiv parallel dimer17, men som reaktion på lav pH og forskydningskræfter udfolder CT sig og skifter β-lag16, 17, hvilket muligvis udløser β-lag i de gentagne områder af Convert 16. NT er monomere under forhold, der afspejler forhold i lumen af ​​kirtlen og medierer opløseligheden af ​​spidroin, men ved reduceret pH fører protonering af en række carboxylsyresidekæder til dimerisering af NT med en pKa på ca. 6,5, hvorved NT stabiliseres og spidroin fikseres i stort. mængder.netværk16,18.NT spiller således en nøglerolle i filamentdannelsen, idet den skifter fra en monomer i belægningen til en dimer i fiberen23,24,25.NT forbliver meget opløseligt og spiralformet under alle betingelser, der er undersøgt til dato16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, hvilket inspirerede dets udvikling som et opløselighedsforøgende mærke til produktion af heterologe proteiner.
Rekombinant mini-edderkoppesilkeprotein, bestående af én NT, én kort gentagelsesregion, én CT og et His6-mærke (His-NT2RepCT) til oprensning, er lige så opløseligt i vandig buffer som naturligt edderkoppesilkeprotein og efterligner naturlige vigtige egenskaber ved silkeedderkop .dækning 25.31.His-NT2RepCT kan spindes til kontinuerlige fibre ved hjælp af en biomimetisk maskine, hvori en pH 8 opløselig belægning ekstruderes i et pH 525,32,33,34,35 vandbad.Bioreaktorfermentering af E. coli, der udtrykker His-NT2RepCT, og efterfølgende efterbehandling resulterede i >14 g/L udbytte efter oprensning.Det høje udbytte, høje opløselighed og tilstrækkelige respons af His-NT2RepCT på sure forhold tilskrives alle NT23, 25, 34.
Her rapporterer vi den hurtige dannelse af transparente hydrogeler fra rekombinante spidroinproteiner, inklusive NT alene, ved at inkubere en proteinopløsning ved 37 °C.Ved at bruge thioflavin T-fluorescens (ThT), Fourier-transformation infrarød spektroskopi (FTIR), kernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR) og transmissionselektronmikroskopi (TEM), fandt vi ud af, at NT- og mikrospider-proteiner gennemgår strukturel transformation til β-sheets og amyloidlignende fibriller når geler dannes.Derudover danner fusionsproteiner af NT og grønt fluorescerende protein (GFP) eller purinnukleosidphosphorylase (PNP) hydrogeler med fuldt funktionelle fusionsfragmenter.High-throughput ekspression i heterologe værter, kombineret med hurtig dannelse af hydrogeler under fysiologiske forhold, åbner muligheden for omkostningseffektiv produktion af hydrogeler med manipulerede funktioner.
I modsætning til de fleste rapporterede rekombinante spidroinproteiner36 er His-NT2RepCT stabil i Tris-HCl-buffer ved pH 8 og kan koncentreres op til 500 mg/ml uden udfældning25.Derfor blev vi overraskede over at opdage, at dette protein hurtigt danner optisk klare, selvbærende hydrogeler, når det inkuberes ved 37°C (fig. 1b-d).Yderligere undersøgelser viste, at His-NT2RepCT-gelering fandt sted over et bredt udvalg af proteinkoncentrationer (10-300 mg/ml), og at denne koncentration var omvendt korreleret med geleringstiden (fig. 1c og supplerende fig. 1).For at finde ud af, hvilke dele af His-NT2RepCT der medierer hydrogeldannelse, undersøgte vi derefter hvert domæne individuelt og i forskellige kombinationer ved hjælp af et kolbeinversionsassay (figur 1a,b).Alle testede fraktioner af rekombinant spidroin dannede geler (ved en proteinkoncentration på 300 mg/ml) på mindre end 1 time, bortset fra udfældet 2Rep (fig. 1b).Dette tyder på, at NT og CT alene, i kombination eller forbundet med gentagelser, kan gelere ved 37°C, og at His6-mærket ikke påvirker denne proces i nogen væsentlig grad.I betragtning af den almindelige opfattelse, at NT er et meget opløseligt og stabilt protein, og at tidligere rapporter om rekombinante spidroinhydrogeler har tilskrevet geleringseffekter til konformationelle ændringer i gentagne regioner og/eller CT'er, kunne NT selv.Opdagelsen af ​​geldannelse var uventet.Supplerende tabel 1) 37, 38, 39. Bemærkelsesværdigt er det, at NT allerede gelerede inden for 10 minutter ved en koncentration på ≥ 300 mg/ml (fig. 1c).Hætteglasinversionseksperimenter med forskellige koncentrationer af NT viste, at ved >50 mg/ml gelerede NT-opløsningen hurtigere end His-NT2RepCT ved den tilsvarende koncentration (w/v, figur 1c).
Skematisk repræsentation af forskellige spidroin-konstruktioner studeret i dette arbejde.b Geltid ved 37 °C for forskellige rekombinante spidroinproteiner (300 mg/ml) verificeret ved at vende hætteglasset.CT-gel med det samme uden inkubation (<300 mg/ml), 2Rep udfælder (300 mg/ml, 5 mm skala).c Geltid for His-NT2RepCT og NT ved angivne proteinkoncentrationer ved 37°C.d Fotografier af His-NT2RepCT og NT hydrogeler med henholdsvis edderkoppen og bogstavet "NT" trykt nedenunder (begge 200 mg/ml, skala 5 mm).
Hydrogeler dannet af forskellige rekombinante spidroinproteiner har lidt forskellige farver, og observation med det blotte øje viser forskellige grader af gennemsigtighed (fig. 1b).NT geler er usædvanligt klare, mens andre geler bliver uigennemsigtige.His-NT2RepCT og NT geler støbt i cylindriske rør kunne fjernes fra formen intakt (fig. 1d).
For at teste, om naturlige edderkoppesilkebelægninger geler under forhold, der nu er fundet at forårsage gelering af de rekombinante spidroinproteiner, blev belægninger indsamlet fra den store ampullakirtel fra den svenske broedderkop (Larinioides sclopetarius).Belægninger blev opbevaret i 20 mM Tris-HCl-buffer ved 50 mg/ml (baseret på målt tørvægt), men ingen gelering blev observeret under den 21 dage lange inkubation ved 37 °C (Supplerende figur 2a).
For at kvantificere disse geler kan rheologiske målinger bruges til at studere geleringsprocessen og bestemme de overordnede mekaniske egenskaber.Især kan overvågning af opbevaringsmodulet (elasticiteten) ved forhøjede temperaturer give information om geleringstemperaturen såvel som belægningens viskoelastiske egenskaber.Temperaturstigningseksperimenter (ved anvendelse af 1°C/min ved 25-45°C, baseret på tidligere undersøgelser med naturlige silkestamopløsninger)40,41 viste, at lagringsmodulet for His-NT2RepCT og NT-opløsninger steg med stigende temperatur.blev forøget (Fig. 2 og Supplerende Fig. 3).Navnlig begyndte NT-modulet at vokse ved en lavere temperatur sammenlignet med His-NT2RepCT, i overensstemmelse med den hurtigere geltid observeret, når NT blev direkte inkuberet med His-NT2RepCT ved 37 °C (figur 1).Efter et efterfølgende fald i temperaturen vendte opbevaringsmodulet ikke tilbage til lavere værdier og forblev over tabsmodulet (se Supplerende Fig. 3), hvilket indikerer termisk irreversibel stabil gelering.Efter gelering varierede det endelige elasticitetsmodul fra 15 til 330 kPa for His-NT2RepCT-hydrogeler ved en koncentration på 100-500 mg/mL, og det endelige elasticitetsmodul for NT-hydrogeler (100-500 mg/mL) varierede fra 2 til 1400 kPa (Fig. , 2 og komplette rampedata) se Supplerende Fig. 3).
a Ændring i temperatur under målinger af His-NT2RepCT (300 mg/mL) og b NT (300 mg/mL) under omrystning.Pilene angiver temperaturtendensen, og den lysere skravering af lagringsmodulets data viser test ved lavere drejningsmomentværdier for instrumentet end specificeret af producenten, hvilket er årsagen til den øgede støj.c Slutmodulakkumulering af His-NT2RepCT og NT efter forhøjet temperatur (100, 300 og 500 mg/ml).Alle modulaflæsninger tages med en frekvens på 0,1 Hz.
Som en potentiel metode til at undersøge konformationelle ændringer forbundet med gelering, optog vi FTIR-spektre af His-NT2RepCT og NT før og efter gelering ved 37 ° C (figur 3a, b).Som forventet svarede spektrene af His-NT2RepCT- og NT-opløsninger til proteiner, der viste α-helix/tilfældig spole sekundær struktur, med et udtalt bånd ved 1645 cm-1.For begge hydrogeler resulterede gelering i dannelsen af ​​to arme i det midterste I-bånd ved ca. 1617 cm-1 og 1695 cm-1 (fig. 3a, b), hvilket indikerer dannelsen af ​​antiparallelle β-arkstrukturer.Disse ændringer kan også tydeligt ses i det respektive andet derivat og forskelsgeleringsspektre (Supplerende Fig. 4b).De to bånd af NT β-laget var mere udtalte end His-NT2RepCT, hvilket indikerer, at det samlede indhold af β-lags bånd i NT-hydrogelen var højere end NT2RepCT-hydrogelen.
et FTIR-absorptionsspektre af His-NT2RepCT og b NT (begge 500 mg/ml) før (opløsning) og efter (gel) inkubation ved 37°C.c TEM-billeder af resuspenderede 50 mg/ml NT2RepCT-geler og d NT.Skala bar 200 nm.e Fiberdiametre af His-NT2RepCT og NT hydrogeler.n = 100 målte fibriller, p < 0,0001.Fejlbjælkerne viser standardafvigelsen.Centrum af fejlstængerne er middelværdien.En uparret t-test (two-tailed) blev brugt til statistisk analyse.f ThT-fluorescens af forskellige rekombinante spidroinproteiner (100 mg/ml) ved 37 °C uden at ryste.g NT (100 mg/ml) podningseksperimenter fra 100 mg/ml NT gel med 0%, 5%, 10% og 20% ​​frø.
Analyse af gelen ved anvendelse af transmissionselektronmikroskopi (TEM) viste, at hydrogelen består af amyloidlignende fibriller (fig. 3c, 3d).NT-dannede fibriller var aflange (5-12 nm i diameter) og uforgrenede, mens His-NT2RepCT-fibriller var kortere i længden og signifikant bredere i diameter (7-16 nm) (fig. 3e).Disse resultater gjorde det muligt for os at følge kinetikken af ​​fibrose ved hjælp af thioflavin T (ThT) assayet.For alle rekombinante spidroinproteiner steg det fluorescerende signal, når prøver blev inkuberet ved 37 °C (fig. 3f, supplerende fig. 5a).I overensstemmelse med dette fund afslørede mikroskopisk undersøgelse af NT og His-NT2RepCT under geleringsbetingelser en ensartet stigning i ThT-fluorescens uden mærkbar lokal akkumulering af ThT-positive aggregater (Supplerende Fig. 5b, c).Dannelsen af ​​ThT-positive fibriller blev ikke ledsaget af en stigning i NT- og His-NTCT-turbiditet (Supplerende Fig. 5d), hvilket betyder, at et netværk af fibriller i gelen kunne dannes uden at kompromittere gelens klarhed.Såning ved at tilsætte små mængder af præformede fibriller kan signifikant accelerere fibrildannelsen af ​​nogle amyloider42,43,44, men tilsætning af 5%, 10% eller 20% (w/w) NT til en opløsning af NT hydrokoagulanter.såningseffekt (fig. 3g).Måske skyldes det, at fibrillerne i hydrogelen er relativt fikserede og ikke kan bruges som frø.
Den uventede opførsel af rekombinante spidroinproteiner ved høje temperaturer foranledigede yderligere nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopiundersøgelser for at identificere konformationelle ændringer forbundet med geldannelse.NMR-spektre af His-NT2RepCT-opløsninger registreret over tid ved 37°C viste, at CT stadig var delvist foldet, hvorimod NT- og 2Rep-signaler var forsvundet (fig. 4a), hvilket tyder på, at det hovedsageligt var NT og 2Rep, der delvist kontrollerede dannelsen af ​​His- NT2RepCT hydrogel.CT-signalet blev også dæmpet til 20% af dets oprindelige intensitet, hvilket tyder på, at CT også for det meste er fikseret og inkorporeret i hydrogelstrukturen.For en mindre del af CT'en, som er lige så mobil som i den præinkuberede prøve og således observeret ved opløsnings-NMR, mangler spektrene signaler for de første 10 strukturerede rester, muligvis på grund af vanskelig immobilisering af den vedhæftede del af His-NT2Rep.NMR-spektrene for -tilstanden af ​​hydrogeler -NT2RepCT afslørede den overvejende tilstedeværelse af α-helixer og β-lag og, i mindre grad, den tilfældige spolekonformation (fig. 4b).Kemisk skiftanalyse af methioninrester, der kun er til stede i NT, viste, at dette domæne var blevet omdannet til en β-arkstruktur.De tidsafhængige spektre af NT i opløsning viste et ensartet fald i signalintensitet (fig. 4c), og faststof-NMR af NT-hydrogeler viste, at de fleste af NT-resterne blev omdannet til β-arkstrukturer (fig. 4d).Konformationen af ​​2Rep kunne ikke bestemmes separat på grund af dens tendens til at aggregere.Faststof-NMR-spektrene for NTCT- og His-NT2RepCT-hydrogelerne lignede imidlertid meget ens (fig. 4b; Supplerende fig. 6b), hvilket tyder på, at 2Rep bidrog lidt til den strukturelle del af His-NT2RepCT-hydrogelen.For CT-hydrogeler blev der fundet a-helixer, β-sheets og tilfældige spiralformede sekundære strukturer (Supplerende Fig. 6d).Dette tyder på, at nogle dele af CT forbliver α-helixer, mens andre bliver β-sheets.Resultaterne af NMR-spektroskopi tyder således på, at NT er vigtig for hydrogeldannelse og også transformeres til en β-sheet-konformation ved fusion med 2Rep og CT.I overensstemmelse med dette fandt vi for nylig, at amyloide rumlige lynlåse sandsynligvis dannes i alle fem helixer i NT-domænet, og Waltz-algoritmen forudsagde en amyloidogen region i helix 1 (fig. 4e).
2D-spektre af 15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT-opløsning før (blå) og 19 timer efter inkubation (rød) ved 37°C.Individuelle krydstoppe i det røde spektrum og F24, G136, polyA i det blå spektrum er angivet med enkeltbogstavs aminosyresymboler og restnumre.Indsætningerne viser afhængigheden af ​​signalintensiteten på tid for udvalgte rester fra NT-, 2Rep- og CT-domænerne.b Solid-state radiofrekvens (RFDR) spektre af His-NT2RepCT hydrogeler.Korrelationer af Cα/Cβ-rester observeret i RFDR-spektre blev bestemt ved sammenligning med modelpeptidkemiske skift og værdier afledt af statistik82,83 og deres sekundære strukturer.SSB – roterende sidebånd.c Endimensionelle spektre af 15N-HSQC 10 mg/ml NT-opløsning under inkubation ved 37 °C i 36 timer.Indsatsen viser volumetrisk intensitet versus tid.d RFDR-spektre i fast tilstand af NT-hydrogeler.Korrelationerne af Ca/Cp-rester og deres sekundære strukturer observeret i RFDR-spektrene er angivet.e Baseret på NT45.79-flimmertilbøjelighedsprofilen fra Zipper-databasen (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Rosetta-energien af ​​hexapeptidets rumlige lynskiftvindue er vist i kcal/mol.Røde søjler angiver hexapeptider med en høj fibrosetilbøjelighed (Rosetta-energi under -23 kcal/mol; under den stiplede linje).Grønne søjler indikerer fragmenter med Rosetta-energier over tærsklen og derfor mindre tilbøjelige til at danne steriske lynlåse.Fragmenter indeholdende prolin blev udelukket fra analysen (uden søjler).Firkanter angiver områder med amyloidose forudsagt af Waltz-algoritmen81 (https://waltz.switchlab.org).Sekvensen af ​​aminosyrerester af NT er øverst, og de typer af rester, der findes i den sekundære β-struktur (bestemt ved faststof-NMR-spektroskopi) er vist med rødt.Positionerne af de fem NT a-helixer er betegnet som (H1-H5)28.
Ved pH <6,5 dimeriserer HT, idet det er modstandsdygtigt over for varme- eller urea-induceret denaturering18.For at belyse, hvordan NT-dimerisering og stabilitet påvirker gelering, blev opløsninger indeholdende 100 mg/ml NT kontrolleret ved pH 8, 7 og 6 ved hjælp af hætteglasinversionstesten.NT-prøver inkuberet ved pH 8 og 7 gelerede efter 30 minutter ved 37 °C, men pH 8-gelen forblev klar, mens pH 7-gelen viste et synligt bundfald (fig. 5a).I modsætning hertil dannede en opløsning indeholdende HT ved pH 6 ikke en gel, og et stort bundfald kunne ses efter 20 minutter ved 37°C.Dette tyder på, at dimerer selv og/eller deres højere stabilitet sammenlignet med monomerer forhindrer gelering.Dannelsen af ​​et bundfald for NT ved pH 7 og 6 var ikke forventet, da det er blevet rapporteret, at NT er opløseligt ved 200 mg/ml27, let genfoldes efter varmedenaturering og også bevarer en α-helix ved lavere værdier på pH 18. En sandsynlig forklaring på disse uoverensstemmelser er, at de tidligere rapporterede forsøg er udført ved stuetemperatur eller derunder, eller ved relativt lave proteinkoncentrationer16,18,19.
NT hætteglasinversionstest (100 mg/ml) ved pH 8, 7, 6 og 154 mM NaCl (pH 8) efter inkubation ved 37°C.b NT CD-spektre med og uden henholdsvis 154 mM NaF og 154 mM NaCl.Molær ellipticitet ved 222 nm omdannes til en andel af naturlige folder.c NT-inversionsassay (100 mg/ml) NT* (37 °C og 60 °C), NTA72R (37 °C) og His-NT-L6 (37 °C og 60 °C).d CD-spektre af NT-mutanter NT*, NTA72R og His-NT-L6.Molær ellipticitet ved 222 nm omdannes til en andel af naturlige folder.e Inversionstest af NTFlSp, NTMiSp og reduceret NTMiSp (100 mg/mL).Skalastang 5 mm.f CD-spektre af NT, NTFlSp, NTMiSp og reduceret NTMiSp.Molær ellipticitet ved 222 nm omdannes til en andel af naturlige folder.Fuld NT-spektre ved 25 °C og 95 °C er vist i supplerende figur 8.
Fysiologisk saltkoncentration bestemmer elektrostatiske interaktioner mellem NT-underenheder og dimerisering af NT-overførsel til lavere pH18.Vi fandt ud af, at tilstedeværelsen af ​​154 mM NaCl og NaF faktisk hæmmede gelering (fig. 5a, b; Supplerende Fig. 2b), og at disse salte øgede den termiske stabilitet af NT-monomerer (Fig. 5b, Supplerende Fig. 8). .Det tyder også på, at stabilitetsforøgelse i stedet for dimerisering forhindrer geldannelse.
For yderligere at udforske rollen af ​​proteindimerisering og stabilitet i gelering brugte vi to mutanter, NT* og NTA72R, som også forbliver monomere ved lav pH28,30.NT* er en dobbeltladningsreverseringsmutant, hvor den tilsyneladende dipolære ladningsfordeling af monomeren er udfladet, hvilket forhindrer dimerisering og øger monomerstabiliteten drastisk.NTA72R er en ladet dipol, men Arg-substitueret Ala er placeret ved dimer-grænsen, så mutationer interfererer med underenhedsinteraktioner, der kræves til dimerisering.Ved inkubation ved 37°C dannede NT* ikke en hydrogel, mens NTA72R dannede en uigennemsigtig gel i 15 minutter (fig. 5c).Da både NT* og NTA72R ikke kan dimerisere, men adskiller sig i monomerstabilitet (fig. 5d), tyder disse resultater stærkt på, at høj termodynamisk stabilitet forhindrer NT i at gelatine.Dette understøttes også af, at HT* danner en gel, når den er ustabil ved høj temperatur (efter 8 min ved 60°C; Fig. 5c).Det er tidligere blevet vist, at det høje indhold af methionin i NT gør dets naturlige foldning flydende, og at seks Met til Leu-erstatninger (her omtalt som His-NT-L6) stabiliserer NT46-monomeren kraftigt.Baseret på antagelsen om, at strukturel fleksibilitet er påkrævet for NT-geldannelse, fandt vi, at den stabile His-NT-L6-mutant ikke gelerede ved 37 °C (figur 5c, d).His-NT-L6 dannede imidlertid også en gel ved inkubation ved 60°C i 60 minutter (fig. 5c).
NT's evne til at transformere til β-arkstrukturer og danne hydrogeler ser ud til at gælde for nogle, men ikke alle, NT-domænerne af spidroin.NT'er fra forskellige silketyper og edderkoppearter, Trichonephila clavipes (NTFlSp), dannede geler på trods af deres relativt lave methioninindhold og høje termiske stabilitet (fig. 5e, f og supplerende tabel 2).I modsætning hertil dannede NT fra det lille ampulære protein spidroin fra Araneus ventricosus (NTMiSp) med lav termisk stabilitet og højt methioninindhold ikke hydrogeler (Supplerende tabel 2 og fig. 5e, f).Sidstnævnte kan være forbundet med tilstedeværelsen af ​​intramolekylære disulfidbindinger29,47.Når disulfidbindingerne af NTMiSp blev reduceret, dannede det konsekvent en hydrogel efter inkubation ved 37°C i 10 minutter (fig. 5e).Afslutningsvis skal det bemærkes, at strukturel fleksibilitet er et vigtigt, men ikke det eneste, kriterium for dannelsen af ​​en gel fra NT.En anden faktor, der kan være relevant, er tilbøjeligheden til at danne amyloide fibriller, og analyse med lynlåsdatabasen og Waltz-algoritmen viste en sammenhæng mellem evnen til at danne geler og tilstedeværelsen af ​​amyloidogene regioner, samt omfanget af de forudsagte regioner. til at danne steriske lynlåse.Der var en sammenhæng (Supplerende Tabel 2 og Supplerende Fig. 9).
NTs evne til at danne fibriller og danne geler under gunstige forhold førte os til at antage, at NT-fusioner med andre proteinfragmenter stadig kan danne geler med fuld funktion af fusionspartnere.For at teste dette introducerede vi henholdsvis grønt fluorescerende protein (GFP) og purin-nukleosidphosphorylase (PNP) ved C-terminalen af ​​NT.De resulterende fusionsproteiner blev udtrykt i E. coli med meget høje slutudbytter (150 mg/L og 256 mg/L rystekolbekulturer for henholdsvis His-NT-GFP og His-NT-PNP), i overensstemmelse med det, der er blevet vist for Andre proteiner fusioneret til NT Ref.30. His-NT-GFP (300 mg/ml) og His-NT-PNP (100 mg/ml) fusionsproteiner dannede geler efter 2 timer og 6,5 timer ved 37°C, og vigtigst af alt forblev GFP-fraktionen uændret.observeret efter gelering med >70 % af den initiale fluorescensintensitet tilbage efter gelering (fig. 6a).For at måle PNP-aktivitet i his-NT-PNP-opløsninger og geler var vi nødt til at fortynde fusionsproteinet med NT, fordi den enzymatiske aktivitet af det rene præparat var uden for detektionsområdet for assayet ved geleringskoncentrationer.Gelen dannet med en blanding indeholdende 0,01 mg/ml His-NT-PNP og 100 mg/ml NT bibeholdt 65% af den initiale enzymatiske aktivitet af de præinkuberede prøver (fig. 6b).Gelen forblev intakt under målingen (Supplerende Fig. 10).
a Relativ fluorescensintensitet før og efter gelering af His-NT-GFP (300 mg/ml) og omvendt hætteglas indeholdende His-NT-GFP hydrogel (300 mg/ml) under synligt og UV-lys.Punkter viser individuelle målinger (n = 3), fejlbjælker viser standardafvigelse.Gennemsnitsværdien vises i midten af ​​fejlbjælkerne.b PNP-aktivitet blev opnået ved fluorometrisk analyse under anvendelse af opløsninger og geler bestående af NT (100 mg/ml) og en blanding indeholdende 0,01 mg/ml his-NT-PNP og 100 mg/ml New Taiwan dollars.Indsatsen viser et omvendt hætteglas indeholdende en hydrogel indeholdende His-NT-PNP (5 mm skala bar).
Her rapporterer vi dannelsen af ​​hydrogeler fra NT og andre rekombinante spidroinproteiner ved at inkubere en proteinopløsning ved 37 °C (figur 1).Vi viser, at gelering er forbundet med transformationen af ​​α-helixer til β-lag og dannelsen af ​​amyloidlignende fibriller (fig. 3 og 4).Dette fund er overraskende, da NT'er er oprullede kugleformede fem-helix bundter kendt for deres ekstremt høje opløselighed og høje stabilitet ved koncentrationer >200 mg/ml ved 4°C i flere dage27.Derudover genfolder NT'er let efter varmedenaturering ved lave proteinkoncentrationer i µM.Ifølge vores resultater kræver fibrildannelse en kombination af >10 mg/ml proteinkoncentration og let forhøjet temperatur (fig. 1).Dette er i overensstemmelse med ideen om, at amyloidfibriller kan dannes fra globulært foldede proteiner, der er i en delvis udfoldet tilstand på grund af termiske udsving under fysiologiske forhold 48 .Eksempler på proteiner, der gennemgår denne omdannelse, omfatter insulin49,50, β2-mikroglobulin, transthyretin og lysozyme51,52,53.Selvom NT er en α-helix i sin native tilstand, er ca. 65 % af polypeptidkæden kompatibel med sterisk lynlåsdannelse (fig. 4e) 45 .Da monomeren er dynamisk mobil46, kan den udsætte disse potentielle amyloidogene regioner ved moderat forhøjede temperaturer, og ved høje koncentrationer af totalt protein kan den nå en kritisk koncentration for amyloid fibrildannelse54.Efter dette ræsonnement fandt vi en negativ sammenhæng mellem spidroinkoncentration og geleringstid (fig. 1c), og hvis den monomere NT-konformation stabiliseres enten ved mutationer (NT*, His-NT-L6) eller ved salttilsætning, kan det forhindre dannelse af hydrogeler (fig. 5).
I de fleste tilfælde forsvinder amyloidfibriller fra opløsning som et bundfald, men under visse betingelser kan de danne hydrogeler55,56,57.Hydrogel-dannende fibriller har typisk et højt aspektforhold og danner stabile tredimensionelle netværk gennem molekylær sammenfiltring,55,58 i overensstemmelse med vores resultater.Til hydrogeldannelse in vitro foldes proteiner ofte helt eller delvist ud, for eksempel ved udsættelse for organiske opløsningsmidler, høj temperatur (70–90°C) og/eller lav pH (1,5–3,0)59,60,61,62.De her beskrevne spidroin-hydrogeler kræver ikke hård behandling, og de kræver heller ikke tværbindingsmidler for at stabilisere hydrogelerne.
Det er tidligere blevet rapporteret, at spidroin-gentagelser og QD'er, som ser ud til at gennemgå β-sheet-skift under silkespinding, danner hydrogeler.Sammenlignet med vores fund var inkubationstider og/eller inkubationstemperaturer henholdsvis signifikant længere eller højere, og de resulterende hydrogeler var ofte uigennemsigtige (figur 7 og supplerende tabel 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Ud over hurtige geltider overgik NT-hydrogeler >300 mg/ml (30 %) alle andre beskrevne rekombinante edderkoppesilkeproteinhydrogeler, såvel som naturlige hydrogeler såsom gelatine, alginat (2 %), agar (0,5 % ) og kollagen.(0,6%) (figur 7 og supplerende tabeller 1 og 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Geltiden og elasticitetsmodulet for hydrogelerne i denne undersøgelse blev sammenlignet med andre spidroin-baserede hydrogeler og udvalgte naturlige hydrogeler.Referencer er givet sammen med en beskrivelse af geleringsbetingelserne.APS Ammoniumpersulfat, stuetemperatur.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Edderkopper ser ud til at have udviklet måder at forhindre spidroin i at gelatine under opbevaring.På trods af den høje koncentration af protein i silkekirtlen betyder den store gentagelsesregion forbundet med det terminale domæne, at den tilsyneladende koncentration af NT og CT i kirtlen svarer til ca. 10-20 mg/ml ved grænsen af ​​denne undersøgelse.kræves for in vitro observeret hydrogeldannelse.Derudover stabiliserede lignende koncentrationer af salte 16 NT, som i silkekirtler (fig. 5b).NT-konformation er blevet undersøgt i E. coli-cytosol og fundet at være tættere foldet end ved undersøgelse in vitro, hvilket yderligere indikerer, at salt eller andre faktorer forhindrer dets aggregering in vivo.Imidlertid kan NT'ers evne til at transformere til β-sheetfibriller være vigtig for filamentdannelse og bør undersøges i fremtidige undersøgelser.
Ud over de nye aspekter af NT-amyloid-lignende fibril- og hydrogeldannelse, der er observeret i denne undersøgelse, viser vi også, at dette fænomen kan have bioteknologiske og biomedicinske anvendelser (fig. 8).Som et bevis på konceptet kombinerede vi NT med GFP eller PNP og viste, at fusionsproteinet også danner hydrogeler, når det inkuberes ved 37 °C, og at GFP- og PNP-fraktionerne stort set bevarer deres aktivitet efter gelering (figur 6).Nukleosidphosphorylaser er vigtige katalysatorer for syntese af nukleosidanaloger75, hvilket gør vores opdagelse relevant for den biofarmaceutiske industri.Konceptet med at udtrykke fusionsproteiner, der danner transparente hydrogeler under gunstige betingelser, tillader skabelsen af ​​funktionaliserede hydrogeler med gunstige egenskaber til en bred vifte af applikationer, såsom enzymimmobilisering, kontrolleret lægemiddelfrigivelse og vævsteknologi.Derudover er NT og NT* effektive ekspressionsmarkører30, hvilket betyder, at NT og dets varianter kan bruges til high-throughput produktion af opløselige fusionsproteiner og efterfølgende skabelse af immobiliserede målproteiner i 3D hydrogeler.
NT er opløseligt, α-spiralformet og stabilt ved lave koncentrationer (µM) og 37°C.Ved samme temperatur, men ved stigende koncentrationer (>10 mg/ml), danner NT geler bestående af amyloidlignende fibriller.NT-fusionsproteiner danner også fibrillære geler med fuldt funktionelle fusionsfragmenter, hvilket gør det muligt at immobilisere forskellige proteiner i 3D-hydrogeler ved hjælp af NT.Nederst: NT (PDB: 4FBS) og illustrationer af fibernetværk og tilhørende proteinstrukturer (antaget og ikke tegnet i skala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ).
Konstruktionerne (se supplerende tabel 4 for en komplet liste inklusive aminosyresekvenser) blev klonet ind i plasmid pT7 og transformeret ind i E. coli BL21 (DE3).E. coli-holdige manipulerede plasmider blev inokuleret i Luria-bouillon suppleret med kanamycin (70 mg/l) og dyrket natten over ved 30°C og 250 rpm.Kulturen blev derefter inokuleret 1/100 i LB-medium indeholdende kanamycin og dyrket ved 30°C og 110 rpm, indtil OD600 nåede 0,8.Til NMR-undersøgelser blev bakterier dyrket i M9 minimalt medium indeholdende 2 g D-glucose 13C (Aldrich) og 1 g ammoniumchlorid 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) til proteinmærkning med isotoper.Sænk temperaturen til 20 grader Celsius og inducer proteinekspression med 0,15 mM isopropylthiogalactopyranosid (slutkoncentration).Efter proteinekspression natten over blev cellerne høstet ved 7278 x g, 4 °C i 20 minutter.Cellepelleter blev resuspenderet i 20 mM Tris-HCl, pH 8, og frosset indtil videre anvendelse.Optøede celler blev lyseret under anvendelse af en cellesprænger (TS-seriens maskiner, Constant Systems Limited, England) ved 30 kPa.Derefter blev lysaterne centrifugeret ved 25.000 g i 30 minutter ved 4°C.For NTMiSp blev pelleten derefter resuspenderet i 2 M urinstof, 20 mM Tris-HCl, pH 8, og sonikeret i 2 minutter (2 s on/off, 65%), derefter centrifugeret igen ved 25.000 xg, 4°C. 30 min.Supernatanten blev sat på en Ni-NTA-søjle, vasket med 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8, og til sidst blev proteinet elueret med 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazol, pH 8. For at generere NT2RepCT og NTCT, thrombinfordøjelse introducerer stedet (ThrCleav) mellem His og NT.Thrombin-spaltningssteder er også til stede i His-NT-ThrCleav-2Rep (producerer 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (producerer NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (producerer CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (producerer NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (producerer NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (producerer NTF1Sp) og His-Svovlredoxin-ThrCleav-NTMiSp (producerer NTMiSp).Konstruktionerne blev fordøjet med thrombin (1:1000) og dialyseret natten over ved 4°C med 20 mM Tris-HCl, pH 8, under anvendelse af en Spectra/Por-dialysemembran med en molekylvægtstærskel på 6-8 kDa.Efter dialyse fyldes opløsningen på en Ni-NTA-søjle, og effluenten indeholdende proteinet af interesse opsamles.Proteinkoncentrationer blev bestemt ved at måle UV-absorbans ved 280 nm under anvendelse af ekstinktionskoefficienten for hvert protein, bortset fra NTF1Sp, som brugte Bradford-assayet i henhold til producentens protokol.Renheden blev bestemt ved SDS polyacrylamid (4-20%) gelelektroforese og Coomassie brilliant blue farvning.Proteiner blev koncentreret under anvendelse af centrifugefiltre (VivaSpin 20, GE Healthcare) ved 4000 xg med en 10 kDa molekylvægt cutoff i 20 minutters cyklusser.
Optø proteinopløsningen og pipetter forsigtigt 150 µl i et 1 ml klart septum-hætteglas (8 x 40 mm Thermo Scientific).Rørene blev lukket og forseglet med parafilm for at forhindre fordampning.Prøver (n = 3) blev inkuberet ved 37°C eller 60°C og periodisk inverteret for at observere geldannelse.Prøver, der ikke gelerede, blev inkuberet i mindst en uge.Reducer NTMiSp disulfidbindinger med 10 mM DTT pr. 10 µM protein.For at analysere geleringen af ​​naturlige edderkoppesilkebelægninger blev den svenske broedderkop skåret, de to hovedampullerede kirtler blev anbragt i 200 μl 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 og skåret for at tillade belægningen at adskille fra kirtlerne..Indholdet af kirtlerne opløses i buffer, 50 µl til bestemmelse af tørvægt (ved inkubation af åbne hætteglas ved 60 °C til konstant vægt) og 150 µl til gelering ved 37 °C.
Målegeometrien/værktøjet er lavet af rustfrit stål med en parallel plade med en topdiameter på 20 mm og et mellemrum på 0,5 mm.Opvarm prøven fra 25 °C til 45 °C og tilbage til 25 °C med en hastighed på 1 °C pr. minut ved at bruge en Peltier-plade i rustfrit stål.Vibrationsmålinger blev udført ved en frekvens på 0,1 Hz og i det lineære viskoelastiske område af materialet ved en belastning på 5% og 0,5% for prøver på henholdsvis 100 mg/ml og 300-500 mg/ml.Brug et brugerdefineret fugtkammer for at forhindre fordampning.Data blev analyseret ved hjælp af Prisme 9.
Til opsamling af infrarøde (IR) spektre ved stuetemperatur fra 800 til 3900 cm–1.ATR-enheden, såvel som lysvejen gennem spektrometeret, renses med tør filtreret luft før og under forsøget.Opløsninger (500 mg/ml for at minimere vandabsorptionstoppene i spektrene) blev pipetteret på krystallerne, og geler (500 mg/ml) blev dannet før måling og derefter overført til krystallerne (n = 3).1000 scanninger blev optaget med en opløsning på 2 cm-1 og nul arbejdscyklus på 2. Den anden afledte blev beregnet ved hjælp af OPUS (Bruker) under anvendelse af et udjævningsområde på ni punkter.Spektrene blev normaliseret til det samme integrationsområde mellem 1720 og 1580 cm-1 ved hjælp af F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".I ATR-IR-spektroskopi er penetrationsdybden af ​​en infrarød stråle i en prøve bølgetalsafhængig, hvilket resulterer i stærkere absorption ved lavere bølgetal end ved højere bølgetal.Disse virkninger er ikke blevet korrigeret for spektrene vist i fig.3, fordi de er meget små (Supplerende Fig. 4).Korrigerede spektre for denne figur blev beregnet ved hjælp af Bruker OPUS-softwaren.
I princippet er en omfattende kvantificering af proteinkonformationer mulig efter pålidelig dekonvolution af komponenterne i amid I-toppen.Der opstår dog nogle forhindringer i praksis.Støj i spektret kan optræde som (falske) toppe under dekonvolution.Derudover falder toppen på grund af vandbøjning sammen med positionen af ​​amid I-toppen og kan have en lignende størrelse for prøver, der indeholder en stor mængde vand, såsom den vandige gel, der er undersøgt her.Derfor forsøgte vi ikke fuldstændigt at nedbryde amid I-toppen, og vores observationer bør kun betragtes som støtte for andre metoder såsom NMR-spektroskopi.
Opløsninger af 50 mg/ml NT og His-NT2RepCT blev geleret natten over ved 37°C.Hydrogelen blev derefter fortyndet med 20 mM Tris-HCl (pH 8) til en koncentration på 12,5 mg/ml, rystet godt og pipetteret for at bryde gelen.Derefter blev hydrogelen fortyndet 10 gange med 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl af prøven blev påført et kobbergitter belagt med formvar, og den overskydende prøve blev fjernet med duppepapir.Prøver blev vasket to gange med 5 µl MilliQ-vand og farvet med 1 % uranylformiat i 5 minutter.Fjern overskydende plet med absorberende papir, og lufttørre derefter nettet.Billeddannelse blev udført på disse gitter under anvendelse af en FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, der opererede ved 100 kV.Billederne blev optaget ved x 26.500 og x 43.000 forstørrelser ved hjælp af et Veleta 2k × 2k CCD-kamera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Tyskland).For hver prøve (n = 1) blev der optaget 10-15 billeder.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) blev brugt til billedanalyse og måling af fiberdiametre (n = 100, forskellige fibre).Prisme 9 blev brugt til at udføre uparrede t-tests (two-tailed).De gennemsnitlige His-NT2RepCT- og NT-fibriller var henholdsvis 11,43 (SD 2,035) og 7,67 (SD 1,389) nm.Konfidensintervallet (95%) er -4,246 til -3,275.frihedsgrader = 198, p < 0,0001.
80 µl væskeprøver indeholdende 10 µM thioflavin T (ThT) blev målt i tre eksemplarer (n = 3) under statiske betingelser under anvendelse af Corning 96-brønds sortbundede klare bundplader (Corning Glass 3881, USA).Fluorescensforskelle blev registreret under anvendelse af et 440 nm excitationsfilter og et 480 nm emissionsfilter (FLUOSTar Galaxy fra BMG Labtech, Offenburg, Tyskland).ThT-signalet var hverken mættet eller quenchet, da eksperimenter med forskellige koncentrationer af ThT blev udført uden at ændre signalintensiteten.Registrer absorbans ved 360 nm til uklarhedsmåling.Til podningseksperimenter blev 100 mg/ml geler dannet ved 37°C, resuspenderet og anvendt til podning i molforhold på 5%, 10% og 20%.Data blev analyseret ved hjælp af Prisme 9.
Optø lagre af His-NT2RepCT og NT >100 mg/ml på is og filtrer gennem et 0,22 µm filter.Koncentrationer blev beregnet ved at måle absorbans ved 280 nm under anvendelse af Nanodrop.I brønde på en 96-brønds sort ikke-bindende plade (Corning) med en klar bund blev prøver fortyndet til 20 mg/ml i 20 mM Tris-HCl pH 8 og blandet med 5 μM ThT (slutkoncentration), total prøvekoncentration 50 μl volumen.Prøver blev afbildet hvert 10. minut ved 37 °C på et CellObserver (Zeiss) mikroskop med transmitteret lyskanal og FITC excitations- og emissionsfiltersæt til ThT-billeddannelse.Et 20x/0,4 objektiv bruges til billeddannelse.Zen Blue (Zeiss) og ImageJ (https://imagej.nih.gov/) blev brugt til billedanalyse.Geler blev også fremstillet ud fra NT- og His-NT2RepCT-opløsninger i en koncentration på 50 mg/ml indeholdende 20 mM Tris pH 8 og 5 µM ThT og inkuberet ved 37°C i 90 min.Gelstykkerne blev overført til en ny brønd indeholdende 20 mM Tris, pH 8 og 5 μM ThT i en ikke-bindende sort 96 brønds klar bundplade.Få grøn fluorescens og lyse feltbilleder ved 20x/0,4 forstørrelse.ImageJ blev brugt til billedanalyse.
Opløsnings-NMR-spektre blev opnået ved 310 K på et 600 MHz Bruker Avance Neo-spektrometer udstyret med en QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR-prøver indeholdende 10 mg/ml homogent protein mærket med 13C, 15N, opløst i 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02 % (vægt/volumen) NaN3, 5 % DO (volumen/volumen), (n = 1) .Kemiske skift af NT2RepCT ved pH 6,7 blev brugt til at tildele top 23 i 2D-spektret af 15N-HSQC.
Magisk vinkel-spindende fast NMR (MAS)-spektre af 13C, 15N-mærkede hydrogeler blev optaget på et Bruker Avance III HD-spektrometer ved 800 MHz udstyret med en 3,2 mm 13C/15N{1H}-elektronløs probe.Prøvetemperaturen blev kontrolleret ved hjælp af en gasstrøm med variabel temperatur ved 277 K. Todimensionel dipolrotationsresonans (DARR)76 og radiofrekvensgenforbindelse (RFDR)77 spektre blev opnået ved MAS-frekvenser på henholdsvis 12,5 kHz og 20 kHz.Krydspolarisering (CP) fra 1H til 13C blev udført ved hjælp af en lineær rampe fra 60,0 til 48,0 kHz ved 1H, 61,3/71,6 kHz ved 13C (ved 12,5/20 kHz MAS) og kontakttid 0,5-1 ms.Spinal6478-afkobling ved 73,5 kHz blev brugt under dataindsamling.Optagelsestiden var 10 millisekunder, og cyklusforsinkelsen var 2,5 sekunder.De enkeltkoblede Cα/Cβ-korrelationer observeret i RFDR-spektrene blev tildelt baseret på de karakteristiske rest-type kemiske skift og multiple-linkede korrelationer i DARR-spektrene.
Zipper79-databasen (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) blev brugt til at evaluere flagrende tendenser og Rosetta-energi for NT, NTFlSp og NTMiSp.Zipper-databasen beregner Rosetta Energy80, som kombinerer flere gratis energifunktioner til at modellere og analysere proteinstruktur.Et energiniveau på -23 kcal/mol eller lavere indikerer en høj tendens til at flimmer.Den lavere energi betyder mere stabilitet af de to β-strenge i lynlåskonformationen.Derudover blev Waltz-algoritmen brugt til at forudsige amyloidogene regioner i NT, NTFlSp og NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT-proteinopløsningen blev blandet med 2-(N-morpholino)ethansulfonsyre (MES) buffer ved pH 5,5 og 6,0 for at sænke pH til henholdsvis pH 6 og 7.Den endelige proteinkoncentration var 100 mg/ml.
Målinger blev udført på et J-1500 CD-spektrometer (JASCO, USA) ved hjælp af en 300 μL kuvette med en optisk vej på 0,1 cm.Proteiner blev fortyndet til 10 μM (n = 1) i 20 mM fosfatbuffer (pH 8).For at analysere proteinstabilitet i nærvær af salt blev proteiner analyseret i samme koncentration (n = 1) i 20 mM phosphatbuffer (pH 8) indeholdende henholdsvis 154 mM NaF eller NaCl.Temperaturscanninger blev registreret ved 222 nm fra 25°C til 95°C med en opvarmningshastighed på 1°C/min.Andelen af ​​naturligt foldede proteiner blev beregnet ved hjælp af formlen (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Derudover blev der registreret fem spektre for hver prøve fra 260 nm til 190 nm ved 25°C og efter opvarmning til 95°C.Fem spektre blev gennemsnittet, udjævnet og omdannet til molær elliptiskhed.Data blev analyseret ved hjælp af Prisme 9.
Fluorescensintensiteten af ​​His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µL) blev målt i tre eksemplarer (n = 3) i 96-brønds Corning-plader med en sort gennemsigtig bund (Corning Glass 3881, USA) under statiske forhold.Mål prøver med en fluorescens-baseret pladelæser med en excitationsbølgelængde på 395 nm og optag emissionen ved 509 nm før gelering og 2 timer senere ved 37 °C.Data blev analyseret med Prisme 9.
Purin nukleosid phosphorylase aktivitet assay kit (fluorometrisk metode, Sigma Aldrich) blev anvendt i overensstemmelse med producentens instruktioner.For at måle aktivitet i geler og opløsninger, der indeholder His-NT-PNP, blandes 10 ng His-NT-PNP med 100 mg/ml NT til et samlet volumen på 2 µL, fordi gelen gav et signal over sættets detektionsinterval.Kontroller for geler og opløsninger uden His-NT-PNP blev inkluderet.Målingerne blev udført to gange (n = 2).Efter at aktiviteten var målt, blev reaktionsblandingen fjernet og gelen fotograferet for at sikre, at gelen forblev intakt under målingen.Data blev analyseret ved hjælp af Prisme 9.
For mere information om undersøgelsesdesign, se Nature study abstract linket til denne artikel.
Figur 1 og 2 viser de indledende data.1c, 2a-c, 3a, b, e-g, 4, 5b, d, f og 6, supplerende fig.3, supplerende fig.5a, d, supplerende fig.6 og supplerende fig.8. Data Data fra denne undersøgelse er hostet i Zenodo-databasen https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.NMR-dataene opnået i denne undersøgelse blev sendt til BMRBig-depotet under post-ID bmrbig36.Strukturerne af GFP og PNP blev taget fra PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. og Johansson, J. Spinding af kunstig edderkoppesilke.National Chemical.biologi.11, 309-315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes-genomet fremhæver mangfoldigheden af ​​edderkoppesilkegener og deres komplekse udtryk.National Genette.49, 895-903 (2017).