304 spolerør i rustfrit stål kemisk komponent, Strukturen af ​​SPACA6 ektodomænet indeholder en bevaret superfamilie af proteiner forbundet med gametfusion.

Tak fordi du besøgte Nature.com.Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).For at sikre løbende support viser vi desuden siden uden styles og JavaScript.
Sliders, der viser tre artikler pr. slide.Brug tilbage- og næste-knapperne til at flytte gennem diasene, eller dias-controllerknapperne i slutningen til at flytte gennem hvert dias.

SPACA6 er et sperm-udtrykt overfladeprotein, der er afgørende for gametfusion under pattedyrs seksuelle reproduktion.På trods af denne grundlæggende rolle er den specifikke funktion af SPACA6 dårligt forstået.Vi belyser krystalstrukturen af ​​det ekstracellulære domæne af SPACA6 ved en opløsning på 2,2 Å, hvilket afslører et to-domæne protein sammensat af et firestrenget bundt og Ig-lignende β-sandwiches forbundet med kvasifleksible linkere.Denne struktur ligner IZUMO1, et andet gametfusionsassocieret protein, hvilket gør SPACA6 og IZUMO1 til stiftende medlemmer af superfamilien af ​​fertiliseringsassocierede proteiner omtalt heri som IST-superfamilien.IST-superfamilien er strukturelt defineret af dens snoede fire-helix-bundt og et par disulfid-forbundne CXXC-motiver.En strukturbaseret AlphaFold-søgning af det humane proteom identificerede yderligere proteinmedlemmer af denne superfamilie;især er mange af disse proteiner involveret i gametfusion.SPACA6-strukturen og dens forhold til andre medlemmer af IST-superfamilien giver det manglende led i vores viden om pattedyrs gametfusion.
Ethvert menneskeliv begynder med to separate haploide kønsceller: faderens sædceller og moderens æg.Denne sæd er vinderen af ​​en intens udvælgelsesproces, hvor millioner af sædceller passerer gennem det kvindelige kønsorgan, overvinder forskellige forhindringer1 og undergår kapacitering, hvilket forbedrer deres motilitet og processen med overfladekomponenter2,3,4.Selvom sperm og oocyt finder hinanden, er processen ikke slut endnu.Oocytten er omgivet af et lag af cumulusceller og en glykoproteinbarriere kaldet zona pellucida, hvorigennem sædceller skal passere for at komme ind i oocytten.Spermatozoer bruger en kombination af overfladeadhæsionsmolekyler og membranassocierede og udskilte enzymer til at overvinde disse endelige barrierer5.Disse molekyler og enzymer lagres hovedsageligt i den indre membran og den akrosomale matrix og detekteres, når den ydre membran af sæden lyseres under den akrosomale reaktion6.Det sidste trin i denne intense rejse er sæd-æg-fusionsbegivenheden, hvor de to celler smelter deres membraner sammen til en enkelt diploid organisme7.Selvom denne proces er banebrydende i menneskelig reproduktion, er de nødvendige molekylære interaktioner dårligt forstået.
Ud over befrugtningen af ​​kønsceller er kemien af ​​fusionen af ​​to lipid-dobbeltlag blevet grundigt undersøgt.Generelt er membranfusion en energisk ugunstig proces, der kræver, at en proteinkatalysator gennemgår en strukturel konformationsændring, der bringer to membraner tættere sammen, bryder deres kontinuitet og forårsager fusion8,9.Disse proteinkatalysatorer er kendt som fusogener og er blevet fundet i utallige fusionssystemer.De er nødvendige for viral indtræden i værtsceller (f.eks. gp160 i HIV-1, stigning i coronavirus, hæmagglutinin i influenzavirus)10,11,12 placenta (syncytin)13,14,15 og gametdannende fusioner i lavere eukaryoter ( HAP2/GCS1 i planter, protister og leddyr) 16,17,18,19.Fusogener til humane kønsceller er endnu ikke blevet opdaget, selvom flere proteiner har vist sig at være kritiske for kønsfællebinding og fusion.Det oocyt-udtrykte CD9, et transmembranprotein, der kræves til fusionen af ​​muse- og menneskelige kønsceller, var den første, der blev opdaget 21,22,23.Selvom dens præcise funktion forbliver uklar, synes en rolle i adhæsion, strukturen af ​​adhæsionsfoci på ægmikrovilli og/eller den korrekte lokalisering af oocytoverfladeproteiner sandsynligvis 24,25,26.De to mest typiske proteiner, der er kritiske for gametfusion, er sædproteinet IZUMO127 og oocytproteinet JUNO28, og deres gensidige association er et vigtigt skridt i gametgenkendelse og adhæsion før fusion.Izumo1 knockout-hanmus og Juno knockout-hanmus er fuldstændig sterile, i disse modeller kommer sædcellerne ind i perivitellinerummet, men kønsceller smelter ikke sammen.Tilsvarende blev konfluens reduceret, når gameter blev behandlet med anti-IZUMO1- eller JUNO27,29-antistoffer i humane in vitro-fertiliseringsforsøg.
For nylig er en nyopdaget gruppe af sædudtrykte proteiner, der fænotypisk ligner IZUMO1 og JUNO20,30,31,32,33,34,35, blevet opdaget.Sperm acrosomal membran-associated protein 6 (SPACA6) er blevet identificeret som essentiel for befrugtning i en storstilet murin mutagenese undersøgelse.Indsættelse af transgenet i Spaca6-genet producerer ikke-smeltelige spermatozoer, selvom disse spermatozoer infiltrerer perivitellinerummet 36 .Efterfølgende knockout-undersøgelser i mus bekræftede, at Spaca6 er påkrævet til gametfusion 30,32.SPACA6 udtrykkes næsten udelukkende i testiklerne og har et lokaliseringsmønster svarende til det for IZUMO1, nemlig inden for spermatozoernes intima før den akrosomale reaktion, og migrerer derefter til den ækvatoriale region efter den akrosomale reaktion 30,32.Spaca6-homologer findes i en række pattedyr og andre eukaryoter 30 , og dets betydning for human gametfusion er blevet påvist ved hæmning af human befrugtning in vitro ved resistens over for SPACA6 30 .I modsætning til IZUMO1 og JUNO forbliver detaljerne i strukturen, interaktionerne og funktionen af ​​SPACA6 uklare.
For bedre at forstå den grundlæggende proces, der ligger til grund for fusionen af ​​menneskelig sæd og æg, som vil gøre os i stand til at informere om fremtidige udviklinger inden for familieplanlægning og fertilitetsbehandling, udførte vi SPACA6 strukturelle og biokemiske undersøgelser.Krystalstrukturen af ​​det ekstracellulære domæne af SPACA6 viser et fire-spiralformet bundt (4HB) og et immunglobulin-lignende (Ig-lignende) domæne forbundet af kvasifleksible regioner.Som forudsagt i tidligere undersøgelser, 7,32,37, er domænestrukturen af ​​SPACA6 magen til den for human IZUMO1, og de to proteiner deler et usædvanligt motiv: 4HB med en trekantet spiralformet overflade og et par disulfid-forbundne CXXC-motiver.Vi foreslår, at IZUMO1 og SPACA6 nu definerer en større, strukturelt beslægtet superfamilie af proteiner forbundet med gametfusion.Ved at bruge funktioner, der er unikke for superfamilien, gennemførte vi en udtømmende søgning efter det strukturelle menneskelige AlphaFold-proteom, og identificerede yderligere medlemmer af denne superfamilie, herunder flere medlemmer involveret i gametfusion og/eller befrugtning.Det ser nu ud til, at der er en fælles strukturel fold og superfamilie af proteiner forbundet med gametfusion, og vores struktur giver et molekylært kort over dette vigtige aspekt af den menneskelige gametfusionsmekanisme.
SPACA6 er et enkelt-pass transmembranprotein med en N-bundet glycan og seks formodede disulfidbindinger (figur S1a og S2).Vi udtrykte det ekstracellulære domæne af human SPACA6 (rest 27-246) i Drosophila S2-celler og oprensede proteinet ved hjælp af nikkelaffinitet, kationbytning og størrelsesudelukkelseskromatografi (fig. S1b).Det oprensede SPACA6 ektodomæne er meget stabilt og homogent.Analyse ved anvendelse af størrelsesudelukkelseskromatografi kombineret med polygonal lysspredning (SEC-MALS) afslørede en top med en beregnet molekylvægt på 26,2 ± 0,5 kDa (fig. S1c).Dette er i overensstemmelse med størrelsen af ​​det SPACA6 monomere ektodomæne, hvilket indikerer, at oligomerisering ikke fandt sted under oprensning.Derudover afslørede cirkulær dikroisme (CD) spektroskopi en blandet α/β-struktur med et smeltepunkt på 51,3 °C (fig. S1d,e).Dekonvolution af CD-spektrene afslørede 38,6% α-spiralformede og 15,8% β-strengede elementer (figur S1d).
SPACA6 ektodomænet blev krystalliseret ved hjælp af tilfældig matrix seeding38, hvilket resulterede i et datasæt med en opløsning på 2,2 Å (tabel 1 og figur S3).Ved at bruge en kombination af fragmentbaseret molekylær substitution og SAD-fasedata med bromideksponering til strukturbestemmelse (tabel 1 og figur S4), består den endelige raffinerede model af resterne 27-246.På det tidspunkt, hvor strukturen blev bestemt, var der ingen eksperimentelle eller AlphaFold-strukturer tilgængelige.SPACA6 ektodomænet måler 20 Å × 20 Å × 85 Å, består af syv helixer og ni β-strenge og har en forlænget tertiær fold stabiliseret af seks disulfidbindinger (fig. 1a, b).Den svage elektrondensitet for enden af ​​Asn243-sidekæden indikerer, at denne rest er en N-bundet glycosylering.Strukturen består af to domæner: et N-terminalt fire-helix-bundt (4HB) og et C-terminalt Ig-lignende domæne med en mellemliggende hængselregion mellem dem (fig. 1c).
en struktur af det ekstracellulære domæne af SPACA6.Stripdiagram af det ekstracellulære domæne af SPACA6, farven på kæden fra N til C-terminus fra mørkeblå til mørkerød.Cysteiner involveret i disulfidbindinger er fremhævet i magenta.b Topologi af det ekstracellulære domæne af SPACA6.Brug samme farveskema som i figur 1a.c SPACA6 ekstracellulært domæne.4HB-, hængsel- og Ig-lignende domænestrimmeldiagrammer er farvet henholdsvis orange, grøn og blå.Lagene er ikke tegnet i skala.
4HB-domænet af SPACA6 omfatter fire hovedspiraler (helixer 1-4), som er arrangeret i form af en spiralformet helix (fig. 2a), der veksler mellem antiparallelle og parallelle interaktioner (fig. 2b).En lille ekstra enkeltdrejet spiral (helix 1′) lægges vinkelret på bundtet, og danner en trekant med spiral 1 og 2. Denne trekant er let deformeret i den spiral-snoede pakning af den relativt tætte pakning af spiral 3 og 4 ( Fig. 2a).
4HB N-terminal strimmeldiagram.b Set fra oven af ​​et bundt af fire helixer, hver helix fremhævet med mørkeblåt ved N-terminalen og mørkerødt ved C-terminalen.c Top-down spiralhjuldiagram for 4HB, med hver rest vist som en cirkel mærket med en enkeltbogstavs aminosyrekode;kun de fire aminosyrer i toppen af ​​hjulet er nummererede.Ikke-polære rester farves gule, polære uladede rester farves grønne, positivt ladede rester farves blå, og negativt ladede rester farves røde.d Trekantede flader af 4HB-domænet med 4HBs i orange og hængsler i grønt.Begge indlæg viser stavformede disulfidbindinger.
4HB er koncentreret om en indre hydrofob kerne, der hovedsageligt består af alifatiske og aromatiske rester (fig. 2c).Kernen indeholder en disulfidbinding mellem Cys41 og Cys55, der forbinder spiral 1 og 2 sammen i en øvre hævet trekant (fig. 2d).To yderligere disulfidbindinger blev dannet mellem CXXC-motivet i Helix 1′ og et andet CXXC-motiv fundet ved spidsen af ​​β-hårnålen i hængselregionen (fig. 2d).En konservativ argininrest med en ukendt funktion (Arg37) er placeret inde i en hul trekant dannet af helixerne 1′, 1 og 2. Alifatiske carbonatomer Cβ, Cγ og Cδ Arg37 interagerer med den hydrofobe kerne, og dens guanidingrupper bevæger sig cyklisk mellem helixer 1' og 1 via interaktioner mellem Thr32-rygraden og sidekæden (fig. S5a,b).Tyr34 strækker sig ind i hulrummet og efterlader to små hulrum, gennem hvilke Arg37 kan interagere med opløsningsmidlet.
Ig-lignende β-sandwich-domæner er en stor superfamilie af proteiner, der deler det fælles træk ved to eller flere flerstrengede amfipatiske β-ark, der interagerer via en hydrofob kerne 39. Det C-terminale Ig-lignende domæne af SPACA6 har samme mønster og består af to lag (fig. S6a).Ark 1 er et β-ark med fire strenge (strenge D, F, H og I), hvor strenge F, H og I danner et anti-parallelt arrangement, og strenge I og D indtager en parallel vekselvirkning.Tabel 2 er et lille anti-parallel dobbeltstrenget beta-ark (strenge E og G).En intern disulfidbinding blev observeret mellem C-terminalen af ​​E-kæden og midten af ​​H-kæden (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Denne disulfidbinding er analog med disulfidbindingen i β-sandwich-domænet af immunoglobulin40,41.
Det firstrengede β-ark snoer sig i hele sin længde og danner asymmetriske kanter, der adskiller sig i form og elektrostatik.Den tyndere kant er en flad hydrofob miljøoverflade, der skiller sig ud sammenlignet med de resterende ujævne og elektrostatisk forskelligartede overflader i SPACA6 (fig. S6b,c).En halo af blottede carbonyl/aminogrupper og polære sidekæder omgiver den hydrofobe overflade (fig. S6c).Den bredere margen er dækket af et lukket spiralformet segment, der blokerer den N-terminale del af den hydrofobe kerne og danner tre hydrogenbindinger med den åbne polære gruppe af F-kædens rygrad (fig. S6d).Den C-terminale del af denne kant danner en stor lomme med en delvist blotlagt hydrofob kerne.Lommen er omgivet af positive ladninger på grund af tre sæt dobbelte argininrester (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 og Arg212-Arg214) og en central histidin (His220) (figur S6e).
Hængselregionen er et kort segment mellem det spiralformede domæne og det Ig-lignende domæne, bestående af et antiparallelt trestrenget β-lag (strenge A, B og C), en lille 310 helix og flere lange tilfældige spiralformede segmenter.(Fig. S7).Et netværk af kovalente og elektrostatiske kontakter i hængselområdet ser ud til at stabilisere orienteringen mellem 4HB og det Ig-lignende domæne.Netværket kan opdeles i tre dele.Den første del inkluderer to CXXC-motiver (27CXXC30 og 139CXXC142), der danner et par disulfidbindinger mellem β-hårnålen i hængslet og 1′ helixen i 4HB.Den anden del omfatter elektrostatiske interaktioner mellem det Ig-lignende domæne og hængslet.Glu132 i hængslet danner en saltbro med Arg233 i det Ig-lignende domæne og Arg135 i hængslet.Den tredje del omfatter en kovalent binding mellem det Ig-lignende domæne og hængselregionen.To disulfidbindinger (Cys124-Cys147 og Cys128-Cys153) forbinder hængselsløjfen til en linker, der er stabiliseret af elektrostatiske interaktioner mellem Gln131 og den funktionelle rygradsgruppe, hvilket giver adgang til det første Ig-lignende domæne.kæde.
Strukturen af ​​SPACA6-ektodomænet og individuelle strukturer af 4HB og Ig-lignende domæner blev brugt til at søge efter strukturelt lignende poster i proteindatabaser 42 .Vi identificerede match med høje Dali Z-scorer, små standardafvigelser og store LALI-scores (sidstnævnte er antallet af strukturelt ækvivalente rester).Mens de første 10 hits fra den fulde ektodomænesøgning (tabel S1) havde en acceptabel Z-score på >842, viste en søgning efter 4HB eller Ig-lignende domæne alene, at de fleste af disse hits kun svarede til β-sandwicher.en allestedsnærværende fold, der findes i mange proteiner.Alle tre søgninger i Dali gav kun ét resultat: IZUMO1.
Det har længe været foreslået, at SPACA6 og IZUMO1 deler strukturelle ligheder7,32,37.Selvom ektodomænerne af disse to gametfusionsassocierede proteiner kun deler 21 % sekvensidentitet (figur S8a), tillod komplekse beviser, herunder et konserveret disulfidbindingsmønster og et forudsagt C-terminalt Ig-lignende domæne i SPACA6, tidlige forsøg på at opbygge en homologimodel af A en SPACA6-mus ved brug af IZUMO1 som skabelon37.Vores struktur bekræfter disse forudsigelser og viser den sande grad af lighed.Faktisk deler SPACA6- og IZUMO137,43,44-strukturerne den samme to-domæne-arkitektur (fig. S8b) med lignende 4HB- og Ig-lignende β-sandwich-domæner forbundet med et hængselområde (fig. S8c).
IZUMO1 og SPACA6 4HB har fælles forskelle fra konventionelle spiralbundter.Typiske 4HB'er, som dem, der findes i SNARE-proteinkomplekser involveret i endosomal fusion 45,46, har jævnt fordelte helixer, der opretholder en konstant krumning omkring en central akse 47. I modsætning hertil var de spiralformede domæner i både IZUMO1 og SPACA6 forvrænget med variabel krumning og ujævn pakning (figur S8d).Vridningen, sandsynligvis forårsaget af trekanten dannet af spiralerne 1′, 1 og 2, er bibeholdt i IZUMO1 og SPACA6 og stabiliseret af det samme CXXC-motiv på helix 1′.Imidlertid skaber den yderligere disulfidbinding, der findes i SPACA6 (Cys41 og Cys55, der kovalent forbinder helix 1 og 2 ovenfor) en skarpere apex ved trekantsspidsen, hvilket gør SPACA6 mere snoet end IZUMO1, med mere udtalte hulrumstrekanter.Derudover mangler IZUMO1 Arg37 observeret i midten af ​​dette hulrum i SPACA6.I modsætning hertil har IZUMO1 en mere typisk hydrofob kerne af alifatiske og aromatiske rester.
IZUMO1 har et Ig-lignende domæne bestående af et dobbeltstrenget og femstrenget β-ark43.Den ekstra streng i IZUMO1 erstatter spolen i SPACA6, som interagerer med F-strengen for at begrænse rygradshydrogenbindinger i strengen.Et interessant sammenligningspunkt er den forudsagte overfladeladning af de Ig-lignende domæner af de to proteiner.IZUMO1-overfladen er mere negativt ladet end SPACA6-overfladen.En ekstra ladning er placeret nær C-terminalen, der vender mod sædmembranen.I SPACA6 var de samme regioner mere neutrale eller positivt ladede (fig. S8e).For eksempel er den hydrofobe overflade (tyndere kanter) og positivt ladede fordybninger (bredere kanter) i SPACA6 negativt ladede i IZUMO1.
Selvom forholdet og sekundære strukturelementer mellem IZUMO1 og SPACA6 er velbevarede, viste den strukturelle justering af de Ig-lignende domæner, at de to domæner adskiller sig i deres generelle orientering i forhold til hinanden (fig. S9).Spiralbundtet af IZUMO1 er buet omkring β-sandwichen, hvilket skaber den tidligere beskrevne "boomerang"-form omkring 50° fra den centrale akse.I modsætning hertil blev den spiralformede stråle i SPACA6 vippet omkring 10° i den modsatte retning.Forskellene i disse orienteringer skyldes sandsynligvis forskelle i hængselregionen.På det primære sekvensniveau deler IZUMO1 og SPACA6 ringe sekvenslighed ved hængslet, med undtagelse af cystein-, glycin- og asparaginsyrerester.Som et resultat er hydrogenbindinger og elektrostatiske netværk helt anderledes.β-sheets sekundære strukturelementer deles af IZUMO1 og SPACA6, selvom kæderne i IZUMO1 er meget længere, og 310 helixen (helix 5) er unik for SPACA6.Disse forskelle resulterer i forskellige domæneorienteringer for to ellers lignende proteiner.
Vores Dali-serversøgning afslørede, at SPACA6 og IZUMO1 er de eneste to eksperimentelt bestemte strukturer, der er gemt i proteindatabasen, der har denne særlige 4HB-fold (tabel S1).For nylig har DeepMind (Alphabet/Google) udviklet AlphaFold, et neuralt netværksbaseret system, der nøjagtigt kan forudsige 3D-strukturerne af proteiner fra primære sekvenser48.Kort efter at vi løste SPACA6-strukturen, blev AlphaFold-databasen frigivet, der giver prædiktive strukturmodeller, der dækker 98,5% af alle proteiner i det humane proteom48,49.Ved at bruge vores opløste SPACA6-struktur som en søgemodel, identificerede en strukturel homologisøgning efter modellen i det humane AlphaFold-proteom kandidater med mulige strukturelle ligheder med SPACA6 og IZUMO1.I betragtning af AlphaFolds utrolige nøjagtighed til at forudsige SPACA6 (fig. S10a) - især 1,1 Å rms ektodomænet sammenlignet med vores opløste struktur (fig. S10b) - kan vi være sikre på, at de identificerede SPACA6-matches sandsynligvis er nøjagtige.
Tidligere søgte PSI-BLAST efter IZUMO1-klyngen med tre andre sæd-associerede proteiner: IZUMO2, IZUMO3 og IZUMO450.AlphaFold forudsagde, at disse IZUMO-familieproteiner folder sig ind i 4HB-domænet med det samme disulfidbindingsmønster som IZUMO1 (figur 3a og S11), selvom de mangler et Ig-lignende domæne.Det antages, at IZUMO2 og IZUMO3 er ensidede membranproteiner, der ligner IZUMO1, mens IZUMO4 ser ud til at blive udskilt.Funktionerne af IZUMO 2, 3 og 4 proteiner i gametfusion er ikke blevet bestemt.IZUMO3 er kendt for at spille en rolle i akrosombiogenese under spermudvikling51, og IZUMO-proteinet har vist sig at danne et kompleks50.Konserveringen af ​​IZUMO-proteiner i pattedyr, krybdyr og padder tyder på, at deres potentielle funktion er i overensstemmelse med den af ​​andre kendte gamete-fusion-associerede proteiner, såsom DCST1/2, SOF1 og FIMP.
Diagram over domænearkitekturen for IST-superfamilien med 4HB, hængsel og Ig-lignende domæner fremhævet i henholdsvis orange, grøn og blå.IZUMO4 har en unik C-terminal region, der ser sort ud.Bekræftede og formodede disulfidbindinger er vist med henholdsvis optrukne og stiplede linjer.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F15), (AlphaFold TM 95) DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) vises i samme farveområde som panel A. Disulfidbindinger er vist i magenta.TMEM95, IZUMO2 og IZUMO3 transmembrane helixer er ikke vist.
I modsætning til IZUMO-proteinet menes andre SPACA-proteiner (dvs. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 og SPACA9) at være strukturelt forskellige fra SPACA6 (fig. S12).Kun SPACA9 har 4HB, men det forventes ikke at have samme parallel-anti-parallelle orientering eller samme disulfidbinding som SPACA6.Kun SPACA1 har et lignende Ig-lignende domæne.AlphaFold forudser, at SPACA3, SPACA4 og SPACA5 har en helt anden struktur end SPACA6.Interessant nok er SPACA4 også kendt for at spille en rolle i befrugtning, men i højere grad end SPACA6, der i stedet letter interaktionen mellem sperm og oocyt zona pellucida52.
Vores AlphaFold-søgning fandt et andet match for IZUMO1 og SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, et enkelt sædspecifikt transmembranprotein, gør hanmus infertile, når de fjernes 32,33.Spermatozoer, der manglede TMEM95, havde normal morfologi, motilitet og evnen til at penetrere zona pellucida og binde sig til ægmembranen, men kunne ikke fusionere med oocytmembranen.Tidligere undersøgelser har vist, at TMEM95 deler strukturelle ligheder med IZUMO133.Faktisk bekræftede AlphaFold-modellen, at TMEM95 er en 4HB med det samme par af CXXC-motiver som IZUMO1 og SPACA6 og den samme yderligere disulfidbinding mellem spiral 1 og 2 fundet i SPACA6 (fig. 3a og S11).Selvom TMEM95 mangler et Ig-lignende domæne, har det et område med et disulfidbindingsmønster svarende til SPACA6- og IZUMO1-hængselregionerne (fig. 3b).På tidspunktet for udgivelsen af ​​dette manuskript rapporterede preprint-serveren strukturen af ​​TMEM95, hvilket bekræfter AlphaFold53-resultatet.TMEM95 er meget lig SPACA6 og IZUMO1 og er evolutionært konserveret allerede i padder (fig. 4 og S13).
PSI-BLAST-søgningen brugte databaserne NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP og SOF1 til at bestemme positionen af ​​disse sekvenser i livets træ.Afstande mellem forgreningspunkter er ikke vist i skala.
Den slående overordnede strukturelle lighed mellem SPACA6 og IZUMO1 antyder, at de er stiftende medlemmer af en konserveret strukturel superfamilie, der inkluderer TMEM95 og IZUMO 2, 3 og 4 proteinerne.kendte medlemmer: IZUMO1, SPACA6 og TMEM95.Fordi kun få medlemmer besidder Ig-lignende domæner, er kendetegnet for IST-superfamilien 4HB-domænet, som har unikke egenskaber, der er fælles for alle disse proteiner: 1) Coiled 4HB med spiraler arrangeret i en anti-parallel/parallel alternering (fig. 5a), 2) bundtet har en trekantet flade bestående af to helixer inden i bundtet og en tredje lodret helix (fig. nøgleområde (fig. 5c) CXXC-motivet, der findes i thioredoxin-lignende proteiner, er kendt for at fungere som en redoxsensor 54,55,56, mens motivet i IST-familiemedlemmer kan associeres med proteindisulfid-isomeraser såsom ERp57 i gametfusion.Roller er forbundet 57,58.
Medlemmer af IST-superfamilien er defineret af tre karakteristiske træk ved 4HB-domænet: fire helixer, der veksler mellem parallel og antiparallel orientering, ba-triangulære spiralformede bundtflader og et ca CXXC dobbeltmotiv dannet mellem små molekyler.) N-terminale helixer (orange) og hængselregion β-hårnål (grøn).
I betragtning af ligheden mellem SPACA6 og IZUMO1 blev førstnævntes evne til at binde til IZUMO1 eller JUNO testet.Biolagsinterferometri (BLI) er en kinetisk-baseret bindingsmetode, der tidligere er blevet brugt til at kvantificere interaktionen mellem IZUMO1 og JUNO.Efter inkubation af den biotin-mærkede sensor med IZUMO1 som lokkemad med en høj koncentration af JUNO-analyt, blev et stærkt signal detekteret (fig. S14a), hvilket indikerer en bindingsinduceret ændring i tykkelsen af ​​biomaterialet, der er fastgjort til sensorspidsen.Lignende signaler (dvs. JUNO koblet til sensoren som lokkemad mod IZUMO1 analyt) (fig. S14b).Der blev ikke detekteret noget signal, når SPACA6 blev brugt som analyt mod sensorbundet IZUMO1 eller sensorbundet JUNO (figur S14a,b).Fraværet af dette signal indikerer, at det ekstracellulære domæne af SPACA6 ikke interagerer med det ekstracellulære domæne af IZUMO1 eller JUNO.
Fordi BLI-analysen er baseret på biotinylering af frie lysinrester på lokkemadproteinet, kan denne modifikation forhindre binding, hvis lysinrester er involveret i interaktionen.Derudover kan orienteringen af ​​bindingen i forhold til sensoren skabe steriske hindringer, så konventionelle pull-down assays blev også udført på de rekombinante SPACA6, IZUMO1 og JUNO ektodomæner.På trods af dette udfældede SPACA6 ikke med His-mærket IZUMO1 eller His-mærket JUNO (fig. S14c, d), hvilket indikerer ingen interaktion i overensstemmelse med den observerede i BLI-eksperimenter.Som en positiv kontrol bekræftede vi interaktionen af ​​JUNO med mærket His IZUMO1 (figur S14e og S15).
På trods af den strukturelle lighed mellem SPACA6 og IZUMO1 er SPACA6's manglende evne til at binde JUNO ikke overraskende.Overfladen af ​​human IZUMO1 har mere end 20 rester, der interagerer med JUNO, inklusive rester fra hver af de tre regioner (selvom de fleste af dem er placeret i hængselregionen) (Fig. S14f).Af disse rester er kun én konserveret i SPACA6 (Glu70).Mens mange restsubstitutioner bibeholdt deres oprindelige biokemiske egenskaber, blev den essentielle Arg160-rest i IZUMO1 erstattet af den negativt ladede Asp148 i SPACA6;Tidligere undersøgelser har vist, at Arg160Glu-mutationen i IZUMO1 næsten fuldstændigt ophæver binding til JUNO43.Derudover øgede forskellen i domæneorientering mellem IZUMO1 og SPACA6 overfladearealet af JUNO-bindingsstedet i den tilsvarende region på SPACA6 signifikant (fig. S14g).
På trods af det kendte behov for SPACA6 til gametfusion og dets lighed med IZUMO1, ser SPACA6 ikke ud til at have en tilsvarende JUNO-bindingsfunktion.Derfor har vi søgt at kombinere vores strukturelle data med beviser for vigtighed leveret af evolutionær biologi.Sekvensjustering af SPACA6-homologer viser bevarelsen af ​​den fælles struktur ud over pattedyr.For eksempel er cysteinrester til stede selv i fjernt beslægtede padder (fig. 6a).Ved hjælp af ConSurf-serveren blev flere sekvensjusteringsretentionsdata på 66 sekvenser kortlagt til SPACA6-overfladen.Denne type analyse kan vise, hvilke rester der er blevet bevaret under proteinudvikling og kan indikere hvilke overfladeregioner der spiller en rolle i funktionen.
en sekvensjustering af SPACA6 ektodomæner fra 12 forskellige arter fremstillet ved hjælp af CLUSTAL OMEGA.Ifølge ConSurf-analysen er de mest konservative positioner markeret med blåt.Cysteinrester er fremhævet med rødt.Domænegrænser og sekundære strukturelementer er vist i toppen af ​​linjeføringen, hvor pile angiver β-strenge og bølger indikerer helixer.NCBI-adgangsidentifikatorerne, der indeholder sekvenserne, er: menneske (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucinabe (Cebus mimic, XP_017359366), hest (Equus caballus, XP3_0235 killer, XP6_0235 killer, XP60235, XP60235, XP60235, XP60235, XP6102ca, XP6102ca, XP60235, XP30235, XP6102ca) 032_034).), får (Ovis aries, XP_014955560), elefant (Loxodonta africana, XP_010585293), hund (Canis lupus familyis, XP_025277208), mus (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil, XPi6_1, XP31, XP31, XP311, XP31, XP31 ), Næbdyr, 8) , 61_89 og Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Nummereringen er baseret på menneskelig orden.b Overfladerepræsentation af SPACA6-strukturen med 4HB øverst og Ig-lignende domæne i bunden, farver baseret på bevarelsesestimater fra ConSurf-serveren.De bedst bevarede dele er i blåt, de moderat bevarede dele er i hvidt, og de mindst bevarede er i gult.lilla cystein.Tre overfladeplastre, der viser et højt beskyttelsesniveau, er vist i de indsatte mærkede plastre 1, 2 og 3. En 4HB tegneserie er vist i indsætningen øverst til højre (samme farveskema).
SPACA6-strukturen har tre meget konserverede overfladeområder (fig. 6b).Patch 1 spænder over 4HB og hængselregionen og indeholder to konserverede CXXC disulfidbroer, et Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 hængselsnetværk (fig. S7) og tre konserverede ydre aromatiske rester (Phe31, Tyr73, Phe137)).en bredere rand af det Ig-lignende domæne (fig. S6e), som repræsenterer flere positivt ladede rester på spermoverfladen.Interessant nok indeholder dette plaster en antistofepitop, som tidligere har vist sig at interferere med SPACA6 30-funktionen.Område 3 spænder over hængslet og den ene side af det Ig-lignende domæne;denne region indeholder konserverede proliner (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) og udadvendte polære/ladede rester.Overraskende nok er de fleste af resterne på overfladen af ​​4HB meget variable (fig. 6b), selvom folden er bevaret i hele SPACA6-homologen (som indikeret ved konservatismen af ​​den hydrofobe bundtkerne) og ud over IST-superfamilien.
Selvom dette er den mindste region i SPACA6 med de færreste påviselige sekundære strukturelementer, er mange hængselregionsrester (inklusive region 3) meget konserverede blandt SPACA6-homologer, hvilket kan indikere, at orienteringen af ​​det spiralformede bundt og β-sandwich spiller en rolle.som konservativ.På trods af omfattende hydrogenbindinger og elektrostatiske netværk i hængselregionen af ​​SPACA6 og IZUMO1, kan der dog ses beviser for iboende fleksibilitet i justeringen af ​​de flere tilladte strukturer af IZUMO137,43,44.Justeringen af ​​de individuelle domæner overlappede godt, men orienteringen af ​​domænerne i forhold til hinanden varierede fra 50° til 70° fra den centrale akse (fig. S16).For at forstå den konformationelle dynamik af SPACA6 i opløsning, blev SAXS eksperimenter udført (fig. S17a, b).Ab initio rekonstruktion af SPACA6 ektodomænet var i overensstemmelse med en stangkrystalstruktur (fig. S18), selvom Kratky-plottet viste en vis grad af fleksibilitet (fig. S17b).Denne konformation står i kontrast til IZUMO1, hvor det ubundne protein antager en boomerangform både i gitteret og i opløsning43.
For specifikt at identificere den fleksible region blev hydrogen-deuterium-udvekslingsmassespektroskopi (H-DXMS) udført på SPACA6 og sammenlignet med data tidligere opnået på IZUMO143 (fig. 7a, b).SPACA6 er klart mere fleksibel end IZUMO1, hvilket fremgår af den højere deuteriumudveksling i hele strukturen efter 100.000 s udveksling.I begge strukturer viser den C-terminale del af hængselregionen et højt niveau af udveksling, hvilket sandsynligvis tillader begrænset rotation af 4HB og Ig-lignende domæner i forhold til hinanden.Interessant nok er den C-terminale del af SPACA6-hængslet, bestående af 147CDLPLDCP154-resten, en meget konserveret region 3 (fig. 6b), hvilket muligvis indikerer, at interdomænefleksibilitet er et evolutionært konserveret træk ved SPACA6.Ifølge fleksibilitetsanalysen viste CD termiske smeltedata, at SPACA6 (Tm = 51,2°C) er mindre stabil end IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Fig. S1e og S19).
a H-DXMS billeder af SPACA6 og b IZUMO1.Den procentvise deuteriumudveksling blev bestemt på de angivne tidspunkter.Niveauer af hydrogen-deuterium-udveksling er angivet med farve på en gradientskala fra blå (10%) til rød (90%).Sorte bokse repræsenterer områder med høj udveksling.Grænserne for 4HB, hængsel og Ig-lignende domæne observeret i krystalstrukturen er vist over den primære sekvens.Deuteriumudvekslingsniveauer ved 10 s, 1000 s og 100.000 s blev plottet på et strimmeldiagram overlejret på de transparente molekylære overflader af SPACA6 og IZUMO1.Dele af strukturer med et deuteriumudvekslingsniveau under 50 % er farvet hvide.Områder over 50 % H-DXMS-udveksling er farvet i en gradientskala.
Brugen af ​​CRISPR/Cas9 og musegen knockout genetiske strategier har ført til identifikation af flere faktorer, der er vigtige for sæd- og ægbinding og fusion.Bortset fra den velkarakteriserede interaktion af IZUMO1-JUNO og CD9 struktur, forbliver de fleste af proteinerne forbundet med gametfusion strukturelt og funktionelt gådefulde.Den biofysiske og strukturelle karakterisering af SPACA6 er en anden del af det molekylære adhæsions-/fusionspuslespil under befrugtning.
SPACA6 og andre medlemmer af IST-superfamilien ser ud til at være meget konserverede i pattedyr såvel som individuelle fugle, krybdyr og padder;faktisk menes det, at SPACA6 endda er påkrævet til befrugtning i zebrafisk 59. Denne fordeling ligner andre kendte gametfusionsassocierede proteiner såsom DCST134, DCST234, FIMP31 og SOF132, hvilket tyder på, at disse faktorer er HAP2-deficiente (også kendt som GCS1) proteiner, der er ansvarlige for den katalytiske aktivitet af mange protister., planter og leddyr.Befrugtede fusionsproteiner 60, 61. På trods af den stærke strukturelle lighed mellem SPACA6 og IZUMO1, resulterede knockout af gener, der koder for et af disse proteiner, i infertilitet hos hanmus, hvilket indikerer, at deres funktioner i gametfusion ikke er duplikeret..Mere generelt er ingen af ​​de kendte sædproteiner, der kræves til adhæsionsfasen af ​​fusion, overflødige.
Det er fortsat et åbent spørgsmål, om SPACA6 (og andre medlemmer af IST-superfamilien) deltager i intergametiske forbindelser, danner intragametiske netværk for at rekruttere vigtige proteiner til fusionspunkter eller måske endda fungerer som undvigende fusogener.Co-immunpræcipitationsundersøgelser i HEK293T-celler afslørede en interaktion mellem fuldlængde IZUMO1 og SPACA632.Vores rekombinante ektodomæner interagerede imidlertid ikke in vitro, hvilket tyder på, at interaktionerne set i Noda et al.blev begge deleteret i konstruktionen (bemærk den cytoplasmatiske hale af IZUMO1, som har vist sig at være unødvendig for befrugtning62).Alternativt kan IZUMO1 og/eller SPACA6 kræve specifikke bindingsmiljøer, som vi ikke reproducerer in vitro, såsom fysiologisk specifikke konformationer eller molekylære komplekser, der indeholder andre proteiner (kendt eller endnu ikke opdaget).Selvom IZUMO1-ektodomænet menes at mediere vedhæftning af spermatozoer til ægget i perivitellinerummet, er formålet med SPACA6-ektodomænet uklart.
Strukturen af ​​SPACA6 afslører flere konserverede overflader, der kan være involveret i protein-protein-interaktioner.Den bevarede del af hængselregionen umiddelbart ved siden af ​​CXXC-motivet (betegnet Patch 1 ovenfor) har flere udadvendte aromatiske rester, der ofte er forbundet med hydrofobe og π-stabling interaktioner mellem biomolekyler.De brede sider af det Ig-lignende domæne (område 2) danner en positivt ladet rille med stærkt konserverede Arg- og His-rester, og antistoffer mod denne region er tidligere blevet brugt til at blokere gametfusion 30 .Antistoffet genkender den lineære epitop 212RIRPAQLTHRGTFS225, som har tre af de seks argininrester og meget konserveret His220.Det er ikke klart, om dysfunktionen skyldes blokering af disse specifikke rester eller hele regionen.Placeringen af ​​dette hul nær C-terminalen af ​​β-sandwichen indikerer cis-interaktioner med nabospermproteiner, men ikke med oocytproteiner.Endvidere kan tilbageholdelsen af ​​et meget fleksibelt prolinrigt virvar (sted 3) i hængslet være stedet for en protein-protein-interaktion eller, mere sandsynligt, indikere bevarelsen af ​​fleksibilitet mellem de to domæner.Køn er vigtigt for den ukendte rolle for SPACA6.fusion af kønsceller.
SPACA6 har egenskaber af intercellulære adhæsionsproteiner, herunder Ig-lignende β-sandwich.Mange adhæsive proteiner (f.eks. cadheriner, integriner, adhæsiner og IZUMO1) har et eller flere β-sandwich-domæner, der strækker proteiner fra cellemembranen til deres miljømål63,64,65.Det Ig-lignende domæne af SPACA6 indeholder også et motiv, der almindeligvis findes i β-sandwich af adhæsion og kohæsion: dubletter af parallelle strenge i enderne af β-sandwicher, kendt som mekaniske klemmer66.Det menes, at dette motiv øger modstanden mod forskydningskræfter, hvilket er værdifuldt for proteiner involveret i intercellulære interaktioner.På trods af denne lighed med adhæsiner er der i øjeblikket ingen beviser for, at SPACA6 interagerer med æggehvider.SPACA6-ektodomænet er ikke i stand til at binde til JUNO, og SPACA6-udtrykkende HEK293T-celler, som vist her, interagerer næppe med oocytter, der mangler zona 32.Hvis SPACA6 etablerer intergametiske bindinger, kan disse interaktioner kræve post-translationelle modifikationer eller blive stabiliseret af andre sædproteiner.Til støtte for sidstnævnte hypotese binder IZUMO1-deficiente spermatozoer til oocytter, hvilket viser, at andre molekyler end IZUMO1 er involveret i gametadhæsionstrin 27.
Mange virale, cellulære og udviklingsmæssige fusionsproteiner har egenskaber, der forudsiger deres funktion som fusogener.For eksempel har virale fusionsglycoproteiner (klasse I, II og III) et hydrofobt fusionspeptid eller -løkke i enden af ​​proteinet, der indsættes i værtsmembranen.Hydrofilicitetskortet for IZUMO143 og strukturen (bestemt og forudsagt) af IST-superfamilien viste intet tilsyneladende hydrofobt fusionspeptid.Så hvis nogle proteiner i IST-superfamilien fungerer som fusogener, gør de det på en anden måde end andre kendte eksempler.
Som konklusion forbliver funktionerne af medlemmerne af IST-superfamilien af ​​proteiner forbundet med gametfusion et fristende mysterium.Vores karakteriserede SPACA6 rekombinante molekyle og dets opløste struktur vil give indsigt i forholdet mellem disse delte strukturer og deres rolle i gamettilknytning og fusion.
DNA-sekvensen svarende til det forudsagte humane SPACA6 ektodomæne (NCBI accessionsnummer NP_001303901.1; rester 27-246) blev kodonoptimeret til ekspression i Drosophila melanogaster S2-celler og syntetiseret som et genfragment med sekvensen kodende for Kozak (Eurofins Genomics)., BiP-sekretionssignalet og de tilsvarende 5'- og 3'-ender til ligeringsuafhængig kloning af dette gen i en pMT-ekspressionsvektor baseret på en metallothionein-promotor modificeret til selektion med puromycin (pMT-puro).pMT-puro-vektoren koder for et thrombin-spaltningssted efterfulgt af en 10x-His C-terminal tag (figur S2).
Stabil transfektion af SPACA6 pMT-puro vektoren ind i D. melanogaster S2 (Gibco) celler blev udført på samme måde som protokollen anvendt til IZUMO1 og JUNO43.S2-celler blev optøet og dyrket i Schneiders medium (Gibco) suppleret med en slutkoncentration på 10% (v/v) varmeinaktiveret føtalt kalveserum (Gibco) og 1X antimykotisk antibiotikum (Gibco).Tidlig passage-celler (3,0 x 106 celler) blev udpladet i individuelle brønde af 6-brøndsplader (Corning).Efter 24 timers inkubation ved 27°C blev celler transficeret med en blanding af 2 mg af SPACA6 pMT-puro vektoren og Effectene transfektionsreagens (Qiagen) i henhold til producentens protokol.Transficerede celler blev inkuberet i 72 timer og derefter høstet med 6 mg/ml puromycin.Celler blev derefter isoleret fra komplet Schneiders medium og anbragt i serumfrit Insect-XPRESS medium (Lonza) til storskala proteinproduktion.En 1 L batch af S2 cellekultur blev dyrket til 8-10 × 106 ml-1 celler i en 2 L ventileret fladbundet polypropylen Erlenmeyer kolbe og derefter steriliseret med en slutkoncentration på 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) og sterilfiltreret.induceret.De inducerede kulturer blev inkuberet ved 27°C ved 120 rpm i fire dage.
Konditioneret medium indeholdende SPACA6 blev isoleret ved centrifugering ved 5660 xg ved 4°C efterfulgt af et Centramate tangential flow-filtreringssystem (Pall Corp) med en 10 kDa MWCO-membran.Påfør koncentreret medium indeholdende SPACA6 på en 2 ml Ni-NTA agaroseharpiks (Qiagen) kolonne.Ni-NTA-harpiksen blev vasket med 10 søjlevolumener (CV) buffer A, og derefter blev 1 CV puffer A tilsat for at give en endelig imidazolkoncentration på 50 mM.SPACA6 blev elueret med 10 ml buffer A suppleret med imidazol til en slutkoncentration på 500 mM.Restriktionsklasse thrombin (Millipore Sigma) blev tilsat direkte til dialyseslangen (MWCO 12-14 kDa) ved 1 enhed pr. mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 og 150 mM NaCl (buffer B) til dialyse.) ved 4°C i 48 timer.Det thrombin-spaltede SPACA6 blev derefter fortyndet tre gange for at reducere saltkoncentrationen og sat på en 1 ml MonoS 5/50 GL kationbyttersøjle (Cytiva/GE) ækvilibreret med 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Kationbytteren blev vasket med 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, derefter blev SPACA6 elueret med en lineær gradient på 0 til 500 mM NaCI i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 i 25 CV.Efter ionbytterkromatografi blev SPACA6 koncentreret til 1 ml og elueret isokratisk fra en ENrich SEC650 10 x 300 kolonne (BioRad) ækvilibreret med buffer B. Ifølge kromatogrammet samles og koncentratfraktioner indeholdende SPACA6.Renheden blev kontrolleret ved Coomassie-farvet elektroforese på en 16% SDS-polyacrylamidgel.Proteinkoncentrationen blev kvantificeret ved absorbans ved 280 nm under anvendelse af Beer-Lambert-loven og den teoretiske molære ekstinktionskoefficient.
Oprenset SPACA6 blev dialyseret natten over mod 10 mM natriumphosphat, pH 7,4 og 150 mM NaF og fortyndet til 0,16 mg/ml før analyse ved CD-spektroskopi.Spektral scanning af CD'er med en bølgelængde på 185 til 260 nm blev opsamlet på et Jasco J-1500 spektropolarimeter under anvendelse af kvartskuvetter med en 1 mm optisk vejlængde (Helma) ved 25°C med en hastighed på 50 nm/min.CD-spektrene blev baseline korrigeret, gennemsnittet over 10 erhvervelser og konverteret til gennemsnitlig resterende ellipticitet (θMRE) i grader cm2/dmol:
hvor MW er molekylvægten af ​​hver prøve i Da;N er antallet af aminosyrer;θ er ellipticiteten i milligrader;d svarer til længden af ​​den optiske vej i cm;proteinkoncentration i enheder.